TaqMan sondas son de hidrólisis sondas que están diseñados para incrementar la especificidad de la PCR cuantitativa . El método fue informado por primera vez en 1991 por el investigador Kary Mullis de Cetus Corporation, [1] y la tecnología fue desarrollada posteriormente por Hoffmann-La Roche para ensayos de diagnóstico y por Applied Biosystems (ahora parte de Thermo Fisher Scientific ) para aplicaciones de investigación.
El principio de la sonda TaqMan se basa en la actividad exonucleasa 5´ – 3´ de la polimerasa Taq para escindir una sonda marcada dual durante la hibridación con la secuencia diana complementaria y la detección basada en fluoróforos . [2] Como en otros métodos de PCR cuantitativa , la señal de fluorescencia resultante permite mediciones cuantitativas de la acumulación del producto durante las etapas exponenciales de la PCR; sin embargo, la sonda TaqMan aumenta significativamente la especificidad de la detección. Las sondas TaqMan recibieron el nombre del videojuego Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan) ya que su mecanismo se basa en el principio Pac-Man.[3]
Principio
Las sondas TaqMan consisten en un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5 'de la sonda oligonucleotídica y un extintor en el extremo 3'. [4] Se encuentran disponibles varios fluoróforos diferentes (p. Ej., 6-carboxifluoresceína , acrónimo: FAM , o tetraclorofluoresceína, acrónimo: TET) y extintores (p. Ej. Tetrametil rodamina , acrónimo: TAMRA). [5] La molécula extintora apaga la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando es excitada por la fuente de luz del ciclador a través de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). [6] Siempre que el fluoróforo y el extintor estén próximos, el extintor inhibe cualquier señal de fluorescencia.
Las sondas TaqMan están diseñadas de tal manera que se aparean dentro de una región de ADN amplificada por un conjunto específico de cebadores. (A diferencia del diagrama, la sonda se une al ADN monocatenario). Las sondas TaqMan se pueden conjugar con un resto ligante de surco menor (MGB), tripéptido de dihidrociclopirroloindol (DPI 3 ), para aumentar su afinidad de unión a la secuencia diana; Las sondas conjugadas con MGB tienen una temperatura de fusión más alta (T m ) debido a una mayor estabilización de las fuerzas de van der Waals. A medida que la polimerasa Taq extiende el cebador y sintetiza la hebra naciente (de nuevo, en una plantilla de hebra única, pero en la dirección opuesta a la que se muestra en el diagrama, es decir, de 3 'a 5' de la hebra complementaria), el 5 ' a 3 'la actividad exonucleasa de la polimerasa Taq degrada la sonda que se ha hibridado con el molde. La degradación de la sonda libera el fluoróforo y rompe la proximidad al extintor, aliviando así el efecto de extinción y permitiendo la fluorescencia del fluoróforo. Por tanto, la fluorescencia detectada en el termociclador de PCR cuantitativa es directamente proporcional al fluoróforo liberado y la cantidad de plantilla de ADN presente en la PCR.
Aplicaciones
Los ensayos basados en sondas TaqMan se utilizan ampliamente en PCR cuantitativa en laboratorios médicos y de investigación :
- Ensayos de expresión génica
- Farmacogenómica
- Genotipificación del antígeno leucocitario humano (HLA)
- Determinación de carga viral en muestras clínicas ( VIH , Hepatitis )
- Ensayos de identificación bacteriana [7]
- Cuantificación de ADN
- Genotipado de SNP
- Verificación de resultados de microarrays
Ver también
notas y referencias
- ^ Holanda, PM; Abramson, RD; Watson, R .; Gelfand, DH (1991). "Detección del producto de reacción en cadena de la polimerasa específico mediante la utilización de la actividad exonucleasa 5 '---- 3' de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 88 (16): 7276–7280. Código Bibliográfico : 1991PNAS ... 88.7276H . doi : 10.1073 / pnas.88.16.7276 . PMC 52277 . PMID 1871133 .
- ^ Expresión del gen TaqMan - Proyectos NCBI
- ^ La PCR de TaqMan en tiempo real y sus aplicaciones en medicina veterinaria: de PacMan a TaqMan, un juego de computadora revisado. Archivado el 5 de mayo de 2009 en la Wayback Machine.
- ^ Sondas TaqMan: Introducción, funcionamiento y aplicaciones
- ^ Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, Singer MJ, Walburger DK, Lokhov SG, Gall AA, Dempcy R, Reed MW, Meyer RB, Hedgpeth J (2000). "Las sondas de ADN del aglutinante de surco 3′-menor aumentan la especificidad de la secuencia a temperaturas de extensión de la PCR" . Ácidos nucleicos Res . 28 (2): 655–661. doi : 10.1093 / nar / 28.2.655 . PMC 102528 . PMID 10606668 .
- ^ Bustin SA (octubre de 2000). "Cuantificación absoluta de ARNm utilizando ensayos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real" . J. Mol. Endocrinol . 25 (2): 169–93. doi : 10.1677 / jme.0.0250169 . PMID 11013345 .
- ^ AlleleID - Diseño de ensayo para identificación bacteriana
enlaces externos
1. Recursos de TaqMan RT-PCR : bases de datos de cebadores, software, protocolos [ enlace muerto ]
2. Beacon Designer : software para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real, incluidos cebadores SYBR Green, sondas TaqMan y balizas moleculares.