La exopolifosfatasa (PPX) es una enzima fosfatasa que cataliza la hidrólisis del polifosfato inorgánico , una molécula lineal compuesta por hasta 1000 o más monómeros unidos por enlaces fosfoanhídrido. [1] PPX es una exofosfatasa procesiva, lo que significa que comienza en los extremos de la cadena de polifosfato y escinde los enlaces fosfoanhídrido para liberar ortofosfato a medida que se mueve a lo largo de la molécula de polifosfato. [1] El PPX tiene varias características que lo distinguen de otras polifosfatasas conocidas, a saber, que no actúa sobre el ATP., tiene una fuerte preferencia por el polifosfato de cadena larga y tiene una afinidad muy baja por las moléculas de polifosfato con menos de 15 monómeros de fosfato. [2]
Exopolifosfatasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
CE no. | 3.6.1.11 | |||||||
No CAS. | 9024-85-5 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
KEGG | Entrada KEGG | |||||||
MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
Ontología de genes | AmiGO / QuickGO | |||||||
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PPX juega un papel importante en el metabolismo del fosfato y la energía en todos los organismos vivos. [3] Es especialmente importante para el mantenimiento de niveles apropiados de polifosfato intracelular , que se ha implicado en una variedad de funciones celulares, incluida la respuesta a factores estresantes como deficiencias de aminoácidos , ortofosfato o nitrógeno , cambios en el pH , reducción de nutrientes y alto contenido de sal y como acompañante molecular inorgánico . [2] [4] La
PPX se clasifica como una polifosfatasa, que forma parte de la gran familia de las fosfoesterasas DHH. [5] Ambas subfamilias dentro de esta superfamilia comparten cuatro motivos N-terminal pero tienen diferentes restos C-terminal . [6]
Actividad PPX se cuantifica mediante la medición de la pérdida de marcado radiactivamente 32 P polifosfato . [1] El PPX se mezcla con una cantidad conocida de polifosfato marcado y la reacción de hidrólisis se detiene con ácido perclórico (HClO 4 ). [1] A continuación, se mide la cantidad de polifosfato marcado restante mediante recuento de centelleo líquido . [1]
Historia
PPX fue descubierto por el laboratorio del premio Nobel Arthur Kornberg en 1993 y es parte del operón polifosfato junto con polifosfato quinasa , [1] la enzima que sintetiza polifosfato . El laboratorio de Kornberg estaba muy interesado en el polifosfato y publicó una serie de artículos que aclaraban el metabolismo y las funciones del polifosfato in vivo . Su interés por el polifosfato los llevó a identificar y caracterizar el operón polifosfato (que incluye polifosfato quinasa [PPK] y PPX) y desarrollar una amplia variedad de ensayos y técnicas para cuantificar la producción y degradación de polifosfato, in vitro e in vivo . Los resultados de estos estudios de polifosfato realizados por el laboratorio de Kornberg llevaron a Kornberg a especular que debido a su alto contenido de energía y fosfato y al grado en que se conserva en todas las especies, el polifosfato puede haber sido el precursor del ARN , el ADN y las proteínas . [2]
Estructura
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/a/a4/1T6C_PPX.png/473px-1T6C_PPX.png)
La estructura de PPX se caracteriza por el dominio ATPasa de tipo actina que forma parte de esta superfamilia. En Aquifex aeolicus que contiene una ribonucleasa H-como adorno que se compone de un Cinco de cadena ß -hoja con la segunda hebra antiparalela al resto. Algunas de las hebras están conectadas por segmentos helicoidales que son más largos en el dominio C-terminal que en el dominio N-terminal. Cinco hélices alfa están ubicadas en el dominio C-terminal y solo dos están ubicadas en el dominio N-terminal. La configuración cerrada de la enzima se denomina estructura de tipo I. Esta configuración comparte características similares a otros miembros de esta superfamilia, incluidos los dominios N-terminal y C-terminal que están separados por dos hélices alfa centradas en la estructura. La disposición más abierta de los dominios muestra el movimiento de rotación de los dos dominios alrededor de una única región de bisagra. La flexibilidad estructural se ha descrito como una hendidura en forma de mariposa que se abre alrededor del sitio activo . [8]
En E. coli , la exopolifosfatasa existe como un dímero , y cada monómero consta de cuatro dominios. Los dos primeros dominios constan de tres hojas beta seguidas de un pliegue alfa-beta-alfa-beta-alfa. Esto es diferente del homólogo de Aquifex aeolicus descrito anteriormente que carece del tercer y cuarto dominios. [9] Hasta la fecha, se han resuelto 4 estructuras para esta clase de enzimas, con códigos de acceso al Protein Data Bank 1T6C , 1T6D , 1U6Z y 2FLO .
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/7/71/1u6z.png/474px-1u6z.png)
Sitio activo
El sitio activo de la exopolifosfatasa se encuentra en las hendiduras entre los dominios I y II. En E. coli, esta región contiene un bucle entre las cadenas beta-1 y beta-2 con los aminoácidos glutamato y aspartato (E121, D143 y E150). Estos residuos, junto con K197, son críticos para la unión de fosfato y de iones, que se observa comúnmente entre otras ASKHA (acetato y quinasas de azúcar, Hsp70 , actina ). En A. aeolicus , el sitio activo de la enzima existe en una hendidura entre los dos dominios. Se ve que los grupos carboxilo catalíticos en esta hendidura son importantes para la actividad enzimática, específicamente Asp141 y Glu148. La preferencia de la exopolifosfatasa por unirse al polifosfato y no al ATP ha contribuido al choque que se produciría entre la ribosa y la adenosina del ATP y las cadenas laterales de N21, C169 y R267. [9]
Mecanismo
La exopolifosfatasa escinde un fosfato terminal del polifosfato a través de las cadenas laterales de aminoácidos del glutamato y la lisina. El glutamato activa el agua, lo que le permite actuar como nucleófilo y atacar el fosfato terminal. El oxígeno que anteriormente estaba uniendo los dos átomos de fosfato luego extrae un hidrógeno del residuo de lisina cercano. [9]
![Exophosphatase mechanism.png](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/e/ed/Exophosphatase_mechanism.png/450px-Exophosphatase_mechanism.png)
Función
Los polifosfatos son utilizados por las enzimas exopolifosfatasa, que escinden porciones de la cadena de fosfatos. Estas proteínas juegan un papel fundamental en el metabolismo y mantenimiento de los polifosfatos. [11] El polifosfato se encuentra en todo el citosol de cada célula y también está presente en los orgánulos celulares . Hay muchas clases de exopolifosfatasas, cada una con su propia localización y propiedades únicas. Se ha especulado que una vez que los polifosfatos se descomponen, están involucrados con moléculas de señalización que actúan como mensajeros secundarios . [6] [12] En E. coli , la regulación del metabolismo de los polifosfatos es poco conocida. [13]
El polifosfato es una cadena lineal de fosfatos unidos por enlaces fosfoanhídrido. El polifosfato se encuentra en todos los organismos vivos y juega un papel esencial en la supervivencia de los organismos. En las bacterias, el polifosfato se usa para almacenar energía para reemplazar el trifosfato de adenosina . También se ha demostrado que está involucrado en la formación y función de la membrana celular, la regulación enzimática y el control transcripcional de genes. En los mamíferos, los polifosfatos están implicados en la coagulación e inflamación de la sangre, la respuesta inmunitaria, el desarrollo del tejido óseo y la función cerebral. [11] [14]
Se ha demostrado en un modelo de levadura que la levadura mutante deficiente en actividad exopolifosfatasa tenía problemas en las funciones respiratorias y el metabolismo de los polifosfatos inorgánicos. [15] Por el contrario, las cepas de levadura que tienen niveles más altos de enzima exopolifosfatasa no muestran defectos de crecimiento obvios en condiciones de deficiencia de fosfato o exceso de fosfato, sin embargo, el nivel de polifosfato en la levadura fue mucho más bajo debido al mayor número de enzimas que rompen el polifosfato cadenas hacia abajo. [dieciséis]
Relevancia clínica / industrial potencial
Los mutantes de E. coli que son incapaces de sintetizar polifosfato mueren después de solo unos pocos días en fase estacionaria . [2] Las estrategias para inhibir la acumulación de polifosfato en bacterias son, por tanto, de interés como posibles tratamientos antibacterianos. [2] [17] Esto se puede lograr mediante la inhibición de la polifosfato quinasa, el aumento de la actividad exopolifosfatasa o ambos.
La acumulación de polifosfato también es de interés para una variedad de aplicaciones industriales, incluida la eliminación de P i de entornos acuáticos mediante la eliminación mejorada de fósforo biológico y por su función como chaperona molecular en la expresión de proteínas recombinantes . Debido a la actividad de polifosfato como una chaperona molecular, [4] cepas de E. coli que se acumulan polifosfato podría utilizarse para aumentar el rendimiento de recombinante soluble de proteína . [18]
La exopolifosfatasa recombinante de Saccharomyces cerevisiae protege contra la mortalidad y restaura las respuestas inmunitarias protectoras en modelos preclínicos de sepsis. [14]
Referencias
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