Recombinación FLP-FRT
En genética , la recombinación Flp- FRT es una tecnología de recombinación dirigida al sitio , cada vez más utilizada para manipular el ADN de un organismo en condiciones controladas in vivo . Es análogo a Cre- lox recombinación , sino que implica la recombinación de secuencias entre objetivo reconocimiento corto flipasa ( FRT ) sitios por la recombinasa flipasa ( Flp ) derivado de la 2 μ plásmido de levadura de panadero Saccharomyces cerevisiae .
para lo cual la flippasa (Flp) se une a ambos brazos 5'-GAAGTTCCTATTC-3 'de 13 pb que flanquean el espaciador de 8 pb, es decir, la recombinación específica del sitio (región de cruce) en orientación inversa. La escisión mediada por FRT se produce justo antes de la región central asimétrica de 8 pb ( 5 'tctagaaa3 ' ) en la hebra superior y detrás de esta secuencia en la hebra inferior. [1] Varios variante FRT existen sitios, pero la recombinación por lo general sólo pueden ocurrir entre dos idénticos FRT s pero generalmente no entre no idéntico ( "heterospecific") FRT s. [2] [3]
En la levadura, esta enzima corrige las disminuciones en el número de copias de plásmido de 2 µ causadas por raros eventos de mala segregación. Lo hace provocando la recombinación entre las dos repeticiones invertidas en el plásmido de 2 µ durante la replicación del ADN . Esto cambia la dirección de una bifurcación de replicación, provocando múltiples rondas de copia en una sola iniciación. [4]
Senecoff y col.(1987) investigaron cómo las sustituciones de nucleótidos dentro del FRT afectaron la eficacia de la recombinación mediada por FLP. Los autores indujeron sustituciones de bases en uno o ambos sitios FRT y probaron la concentración de FLP requerida para observar recombinaciones específicas del sitio. Cada sustitución de bases se realizó en cada uno de los trece nucleótidos dentro del sitio FRT (ejemplo G a A, T y C). Primero, los autores demostraron que la mayoría de las mutaciones dentro de la secuencia FRT causan efectos mínimos si están presentes en solo uno de los dos sitios. Si se produjeron mutaciones en ambos sitios, la eficacia de FLP se reduce drásticamente. En segundo lugar, los autores proporcionaron datos para los que los nucleótidos son más cruciales para la unión de FLP y la eficacia de la recombinación específica del sitio. Si el primer nucleótido en ambos sitios FRT se sustituye por una citosina (G a C),el tercer nucleótido se sustituye por una timina (A a T), o el séptimo nucleótido se sustituye por una adenosina (G a A), entonces la eficacia de la recombinación específica de sitio mediada por FLP se reduce más de 100 veces.[5] Mientras que una sustitución de base de cualquiera de los nucleótidos antes mencionados en solo uno de los sitios FRT condujo a una reducción de la eficacia de diez, diez y cinco veces, respectivamente. [5]
Las sustituciones de bases en los nucleótidos en mayúsculas condujeron a la mayor reducción en la recombinación específica de sitio mediada por FLP (mutante x tipo salvaje y mutante x mutante):
Muchas construcciones disponibles incluyen secuencias de brazos adicionales (5'-GAAGTTCCTATTCC-3 ') un par de bases alejado del elemento aguas arriba y en la misma orientación:
