La recombinación Cre-Lox es una tecnología de recombinasa específica de sitio , que se utiliza para realizar deleciones , inserciones , translocaciones e inversiones.en sitios específicos del ADN de las células. Permite que la modificación del ADN se dirija a un tipo de célula específico o se active mediante un estímulo externo específico. Se implementa tanto en sistemas eucariotas como procariotas. El sistema de recombinación Cre-lox ha sido particularmente útil para ayudar a los neurocientíficos a estudiar el cerebro en el que los tipos de células complejas y los circuitos neuronales se unen para generar cognición y comportamientos. NIH Blueprint for Neuroscience Research ha creado varios cientos de líneas de ratón controlador Cre que actualmente utiliza la comunidad de neurociencia en todo el mundo.
El sistema consta de una sola enzima, Cre recombinasa , que recombina un par de secuencias diana cortas llamadas secuencias Lox . Este sistema se puede implementar sin insertar proteínas o secuencias de soporte adicionales. La enzima Cre y el sitio Lox original llamado secuencia LoxP se derivan del bacteriófago P1 .
La colocación apropiada de secuencias de Lox permite que los genes se activen, repriman o intercambien por otros genes. A nivel de ADN se pueden realizar muchos tipos de manipulaciones. La actividad de la enzima Cre se puede controlar para que se exprese en un tipo de célula particular o se active por un estímulo externo como una señal química o un choque térmico. Estos cambios de ADN dirigidos son útiles en el rastreo del linaje celular y cuando los mutantes son letales si se expresan globalmente.
El sistema Cre-Lox es muy similar en acción y uso al sistema de recombinación FLP-FRT . [1]
Historia
La recombinación Cre-Lox es un tipo especial de recombinación específica de sitio desarrollada por el Dr. Brian Sauer y patentada por DuPont que operaba tanto en células mitóticas como no mitóticas, y se utilizó inicialmente para activar la expresión génica en líneas celulares de mamíferos. [2] [3] [4] Posteriormente, los investigadores del laboratorio del Dr. Jamey Marth demostraron que la recombinación Cre-Lox podría usarse para eliminar secuencias de ADN cromosómico flanqueadas por loxP con alta eficiencia en células T específicas en desarrollo de animales transgénicos. y los autores proponen que este enfoque podría usarse para definir la función génica endógena en tipos celulares específicos, marcar de manera indeleble a los progenitores en estudios de determinación del destino celular, inducir reordenamientos cromosómicos específicos para el modelado biológico y de enfermedades, y determinar los roles de las lesiones genéticas tempranas en la enfermedad ( y fenotipo) mantenimiento. [5]
Poco después, los investigadores del laboratorio del profesor Klaus Rajewsky informaron de la producción de células madre embrionarias pluripotentes que llevan un gen de ADN polimerasa flanqueado por loxP (floxed). [6] Combinando estos avances en colaboración, los laboratorios de los Dres. Marth y Rajewsky informaron en 1994 que la recombinación Cre-lox podría usarse para el direccionamiento condicional de genes. [7] Observaron que aproximadamente el 50% del gen beta de la ADN polimerasa se eliminó en las células T basándose en la transferencia de ADN. No estaba claro si solo un alelo en cada célula T o el 50% de las células T tenían un 100% de deleción en ambos alelos. Desde entonces, los investigadores han informado una mutagénesis genética condicional Cre-Lox más eficiente en las células T en desarrollo por el laboratorio de Marth en 1995. [8] La deleción incompleta por recombinasa Cre no es infrecuente en las células cuando existen dos copias de secuencias floxadas, y permite la formación y estudio de tejidos quiméricos. Se ha demostrado que todos los tipos de células probados en ratones experimentan recombinación Cre transgénica.
Independientemente, Joe Z. Tsien ha sido pionero en el uso del sistema Cre-loxP para la manipulación de genes específicos de la región y el tipo de célula en el cerebro adulto, donde pueden existir cientos de tipos distintos de neuronas y se sabe que casi todas las neuronas del cerebro adulto son post. -mitótico. [9] Tsien y sus colegas demostraron que la recombinación mediada por Cre puede ocurrir en las neuronas piramidales posmitóticas en el prosencéfalo del ratón adulto. [10]
Estos desarrollos han llevado a un uso generalizado de la mutagénesis condicional en la investigación biomédica, que abarca muchas disciplinas en las que se convierte en una plataforma poderosa para determinar la función genética en tipos celulares específicos y en momentos de desarrollo específicos. En particular, la clara demostración de su utilidad para definir con precisión la relación compleja entre células / circuitos específicos y comportamientos para la investigación del cerebro, [11] ha promovido a los NIH a iniciar el Proyecto de NIH para la Investigación en Neurociencias con proyectos de ratones Cre-driver a principios de 2000. [12] [13] Hasta la fecha, los proyectos Cre de NIH Blueprint for Neuroscience Research han creado varios cientos de líneas de ratón controlador Cre que actualmente son utilizadas por la comunidad de neurociencia mundial.
Descripción general
La recombinación Cre-Lox implica dirigir una secuencia específica de ADN y empalmarla con la ayuda de una enzima llamada Cre recombinasa . La recombinación Cre-Lox se usa comúnmente para evitar la letalidad embrionaria causada por la inactivación sistémica de muchos genes. [14] [15] A partir de febrero de 2019, la recombinación Cre-Lox es una herramienta poderosa y se utiliza en el modelado de animales transgénicos para vincular genotipos con fenotipos. [11] [16] [17]
El sistema Cre-lox se utiliza como herramienta genética para controlar los eventos de recombinación específicos del sitio en el ADN genómico. Este sistema ha permitido a los investigadores manipular una variedad de organismos genéticamente modificados para controlar la expresión génica, eliminar secuencias de ADN no deseadas y modificar la arquitectura cromosómica.
La proteína Cre es una recombinasa de ADN específica de un sitio que puede catalizar la recombinación de ADN entre sitios específicos en una molécula de ADN. Estos sitios, conocidos como secuencias loxP , contienen sitios de unión específicos para Cre que rodean una secuencia central direccional donde puede ocurrir la recombinación.
Cuando las células que tienen sitios loxP en su genoma expresan Cre, puede ocurrir un evento de recombinación entre los sitios loxP . Las proteínas Cre recombinasa se unen a la primera y última región de 13 pb de un sitio lox formando un dímero . Este dímero luego se une a un dímero en otro sitio lox para formar un tetrámero . Los sitios Lox son direccionales y los dos sitios unidos por el tetrámero tienen una orientación paralela. El ADN de doble hebra se corta en ambos sitios loxP por la proteína Cre. Luego, las hebras se vuelven a unir con la ADN ligasa en un proceso rápido y eficiente. El resultado de la recombinación depende de la orientación de los sitios loxP . Para dos sitios lox en el mismo brazo cromosómico, los sitios loxP invertidos provocarán una inversión del ADN interviniente, mientras que una repetición directa de los sitios loxP provocará un evento de deleción. Si los sitios loxP están en diferentes cromosomas, es posible que los eventos de translocación sean catalizados por la recombinación inducida por Cre. Se pueden unir dos plásmidos utilizando los sitios lox variantes 71 y 66. [18]
Cre recombinasa
La proteína Cre (codificada por el locus originalmente denominado "Causa recombinación", con "Ciclización recombinasa" que se encuentra en algunas referencias) [19] [20] consta de 4 subunidades y dos dominios: El dominio carboxilo ( C-terminal ) más grande y dominio amino ( N-terminal ) más pequeño . La proteína total tiene 343 aminoácidos . El dominio C es similar en estructura al dominio de la familia Integrasa de enzimas aisladas del fago lambda . Este es también el sitio catalítico de la enzima.
sitio loxP
loxP (locus de X-over P1) es un sitio en el bacteriófago P1 que consta de 34 pb . El sitio incluye una secuencia asimétrica de 8 pb, variable excepto por las dos bases del medio, entre dos conjuntos de secuencias simétricas de 13 pb. La secuencia exacta se da a continuación; 'N' indica bases que pueden variar, y las letras minúsculas indican bases que han sido mutadas del tipo salvaje. Las secuencias de 13 pb son palindrómicas, pero el espaciador de 8 pb no lo es, lo que confiere a la secuencia loxP una cierta dirección. Por lo general, los sitios loxP vienen en pares para la manipulación genética. Si los dos sitios loxP están en la misma orientación, se escinde la secuencia floxed (secuencia flanqueada por dos sitios loxP); sin embargo, si los dos sitios loxP están en la orientación opuesta, la secuencia floxed se invierte. Si existe una secuencia de donantes floxed, la secuencia de donantes se puede intercambiar con la secuencia original. Esta técnica se llama intercambio de casetes mediado por recombinasa y es una forma muy conveniente y que ahorra tiempo para la manipulación genética. Sin embargo, la advertencia es que la reacción de recombinación puede ocurrir al revés, lo que hace que el intercambio de casetes sea ineficaz. Además, la escisión de la secuencia puede ocurrir en trans en lugar de en un evento de intercambio de casetes en cis . Los mutantes loxP se crean para evitar estos problemas. [21]
13pb | 8 pb | 13pb |
ATAACTTCGTATA - | NNNTANNN | -TATACGAAGTTAT |
Nombre | Región de reconocimiento de 13 pb | Región espaciadora de 8 pb | Región de reconocimiento de 13 pb |
---|---|---|---|
Tipo salvaje | ATAACTTCGTATA | ATGTATGC | TATACGAAGTTAT |
lox 511 | ATAACTTCGTATA | ATGTATaC | TATACGAAGTTAT |
lox 5171 | ATAACTTCGTATA | ATGTgTaC | TATACGAAGTTAT |
lox 2272 | ATAACTTCGTATA | AaGTATcC | TATACGAAGTTAT |
M2 | ATAACTTCGTATA | AgaaAcca | TATACGAAGTTAT |
M3 | ATAACTTCGTATA | taaTACCA | TATACGAAGTTAT |
M7 | ATAACTTCGTATA | AgaTAGAA | TATACGAAGTTAT |
M11 | ATAACTTCGTATA | cgaTAcca | TATACGAAGTTAT |
lox 71 | TACCGTTCGTATA | NNNTANNN | TATACGAAGTTAT |
lox 66 | ATAACTTCGTATA | NNNTANNN | TATACGAACGGTA |
Uniones de Holliday y recombinación homóloga
Durante la recombinación genética, se forma una unión de Holliday entre las dos hebras de ADN y una ruptura de doble hebra en una molécula de ADN deja expuesto un extremo 3'OH. Esta reacción se ve favorecida por la actividad endonucleasa de una enzima. Los extremos de fosfato 5 'son generalmente los sustratos para esta reacción, por lo que quedan regiones 3' extendidas. Este grupo 3 'OH es muy inestable y la hebra en la que está presente debe encontrar su complemento. Dado que la recombinación homóloga ocurre después de la replicación del ADN, hay dos cadenas de ADN disponibles y, por lo tanto, el grupo 3 'OH debe emparejarse con su complemento, y lo hace, con una cadena intacta en el otro dúplex. Ahora, ha ocurrido un punto de cruce, que es lo que se llama Intermedio de Holliday.
El extremo 3'OH se alarga (es decir, se añaden bases) con la ayuda de la ADN polimerasa. El emparejamiento de hebras opuestas es lo que constituye el evento de cruce o recombinación, que es común a todos los organismos vivos, ya que el material genético de una hebra de un dúplex se ha apareado con una hebra de otro dúplex y ha sido alargado por la ADN polimerasa. . La escisión adicional de los intermedios de Holliday da como resultado la formación de ADN híbrido.
Esta escisión o "resolución" adicional se realiza mediante un grupo especial de enzimas llamadas Resolvases. RuvC es solo uno de estos Resolvases que se han aislado en bacterias y levaduras.
Durante muchos años, se pensó que cuando se formaba el intermedio de unión de Holliday, el punto de ramificación de la unión (donde las hebras se cruzan) estaría ubicado en el primer sitio de escisión. La migración del punto de ramificación al segundo sitio de escisión desencadenaría de alguna manera la segunda mitad de la vía. Este modelo proporcionó una explicación conveniente para el requisito estricto de homología entre los sitios de recombinación, ya que la migración de las ramas se detendría en un desajuste y no permitiría que ocurriera el intercambio de la segunda hebra. En años más recientes, sin embargo, este punto de vista ha sido cuestionado, y la mayoría de los modelos actuales para la recombinación de Int, Xer y Flp involucran solo una migración de ramificación limitada (1-3 pares de bases del intermedio de Holliday), junto con un evento de isomerización que es responsable de cambiar la especificidad de escisión de la hebra.
Recombinación específica del sitio
La recombinación específica de sitio (SSR) involucra sitios específicos para la acción catalizadora de enzimas especiales llamadas recombinasas. Cre, o recombinasa cíclica, es una de esas enzimas. La recombinación específica de sitio es, por tanto, la escisión y ligación mediada por enzimas de dos secuencias de desoxinucleótidos definidas.
Se han descrito varios sistemas de recombinación específicos de sitio conservados en organismos tanto procarióticos como eucarióticos. En general, estos sistemas utilizan una o más proteínas y actúan sobre secuencias de ADN asimétricas únicas. Los productos del evento de recombinación dependen de la orientación relativa de estas secuencias asimétricas. Muchas otras proteínas, además de la recombinasa, participan en la regulación de la reacción. Durante la recombinación de ADN específica del sitio, que provoca el reordenamiento genético en procesos como la integración y escisión viral y la segregación cromosómica, estas enzimas recombinasas reconocen secuencias de ADN específicas y catalizan el intercambio recíproco de cadenas de ADN entre estos sitios.
Mecanismo de acción
El inicio de la recombinación específica de un sitio comienza con la unión de las proteínas de recombinación a sus respectivos objetivos de ADN. Una recombinasa separada reconoce y se une a cada uno de los dos sitios de recombinación en dos moléculas de ADN diferentes o dentro de la misma cadena de ADN. En el sitio específico dado en el ADN, el grupo hidroxilo de la tirosina en la recombinasa ataca un grupo fosfato en la cadena principal del ADN usando un mecanismo de transesterificación directo . Esta reacción une la proteína recombinasa al ADN a través de un enlace fosfotirosina. Esto conserva la energía del enlace fosfodiéster, lo que permite que la reacción se invierta sin la participación de un cofactor de alta energía.
La escisión en la otra hebra también provoca un enlace fosfotirosina entre el ADN y la enzima. En ambos dúplex de ADN, la unión del grupo fosfato a los residuos de tirosina deja un grupo 3 'OH libre en la cadena principal del ADN. De hecho, el complejo enzima-ADN es una etapa intermedia, a la que sigue la unión del grupo 3 'OH de una hebra de ADN al grupo fosfato 5' de la otra hebra de ADN, que se une covalentemente al residuo de tirosina; es decir, se rompe el enlace covalente entre el extremo 5 'y el residuo de tirosina. Esta reacción sintetiza la unión de Holliday discutida anteriormente.
De esta manera, las hebras de ADN opuestas se unen. La escisión y la unión posteriores hacen que las cadenas de ADN intercambien sus segmentos. Las interacciones proteína-proteína impulsan y dirigen el intercambio de hebras. La energía no se ve comprometida, ya que el enlace proteína-ADN compensa la pérdida del enlace fosfodiéster, que se produjo durante la escisión.
La recombinación específica del sitio también es un proceso importante que los virus, como los bacteriófagos, adoptan para integrar su material genético en el huésped infectado. El virus, llamado profago en tal estado, logra esto a través de la integración y la escisión. Los puntos donde ocurren las reacciones de integración y escisión se denominan sitios de unión (att). Un sitio attP en el fago intercambia segmentos con un sitio attB en el ADN bacteriano. Por lo tanto, estos son específicos del sitio, y ocurren solo en los respectivos sitios att. La clase de enzimas integrasa cataliza esta reacción en particular.
Eficiencia de acción
Se ha demostrado que dos factores afectan la eficacia de la escisión de Cre en el par lox. Primero, la identidad de la secuencia de nucleótidos en la región espaciadora del sitio lox. Las variantes de lox manipuladas que difieren en la región espaciadora tienden a tener una eficiencia de recombinación variada pero generalmente menor en comparación con la loxP de tipo salvaje, presumiblemente al afectar la formación y resolución del intermedio de recombinación. [23]
Otro factor es la longitud del ADN entre el par lox. El aumento de la longitud del ADN conduce a una disminución de la eficiencia de la recombinación Cre / lox posiblemente a través de la regulación de la dinámica de la reacción. [24] [25] [26] La ubicación genética de la secuencia floxed afecta la eficiencia de la recombinación y probablemente al influir en la disponibilidad de ADN por la recombinasa Cre . [26] La elección del controlador Cre también es importante, ya que la baja expresión de la recombinasa Cre tiende a producir una recombinación no paralela. La recombinación no paralela es especialmente problemática en un escenario de mapeo del destino en el que un evento de recombinación está diseñado para manipular el gen en estudio y el otro evento de recombinación es necesario para activar un gen indicador (que generalmente codifica una proteína fluorescente) para el rastreo del linaje celular . [26] Si no se activan ambos eventos de recombinación simultáneamente, se confunde la interpretación de los resultados del mapeo del destino celular .
Control temporal
La activación inducible de Cre se logra utilizando la variante CreER (receptor de estrógeno), que solo se activa después de la administración de tamoxifeno . [27] Esto se hace mediante la fusión de un dominio de unión de ligando mutado del receptor de estrógeno a la recombinasa Cre, lo que da como resultado que Cre se active específicamente por el tamoxifeno. En ausencia de tamoxifeno, CreER dará como resultado el transporte de la recombinasa mutada al citoplasma. La proteína permanecerá en este lugar en su estado inactivo hasta que se administre tamoxifeno. Una vez que se introduce el tamoxifeno, se metaboliza en 4-hidroxitamoxifeno, que luego se une al RE y da como resultado la translocación del CreER al núcleo, donde luego es capaz de escindir los sitios lox. [28] Es importante destacar que, a veces, los indicadores fluorescentes pueden activarse en ausencia de tamoxifeno, debido a la fuga de algunas moléculas de recombinasa Cre en el núcleo que, en combinación con indicadores muy sensibles, da como resultado un marcaje celular no deseado. [29] CreER (T2) se desarrolló para minimizar la recombinación independiente del tamoxifeno y maximizar la sensibilidad al tamoxifeno.
Rastreo de linaje celular condicional
Las células alteran su fenotipo en respuesta a numerosos estímulos ambientales y pueden perder la expresión de genes que normalmente se utilizan para marcar su identidad, lo que dificulta la investigación de la contribución de ciertos tipos de células a la enfermedad. Por lo tanto, los investigadores a menudo usan ratones transgénicos que expresan la recombinasa CreER t2 inducida por la administración de tamoxifeno, bajo el control de un promotor de un gen que marca el tipo celular específico de interés, con un reportero de proteína fluorescente dependiente de Cre. La recombinasa Cre se fusiona con una forma mutante del receptor de estrógeno, que se une al estrógeno sintético 4-hidroxitamoxifeno en lugar de su ligando natural 17β-estradiol. CreER (T2) reside dentro del citoplasma y solo puede trasladarse al núcleo después de la administración de tamoxifeno, lo que permite un estricto control temporal de la recombinación. El casete indicador fluorescente contendrá un promotor para permitir una alta expresión del indicador transgénico fluorescente (por ejemplo, un promotor CAG) y un casete de parada flanqueado por loxP, asegurando que la expresión del transgén sea dependiente de la recombinasa Cre y la secuencia del indicador. Tras la recombinación impulsada por Cre, se escinde el casete de parada, lo que permite que los genes indicadores se expresen específicamente en células en las que la expresión de Cre está impulsada por el promotor marcador específico de la célula. Dado que la eliminación del casete de parada es permanente, los genes indicadores se expresan en toda la progenie producida por las células iniciales en las que una vez se activó Cre. Tal rastreo de linaje condicional ha demostrado ser extremadamente útil para identificar eficiente y específicamente células de músculo liso vascular (VSMC) y células derivadas de VSMC y se ha utilizado para probar efectos sobre VSMC y células derivadas de VSMC in vivo. [30] [31] [32] [33] [34] [35]
Función natural del sistema Cre-lox
El fago P1 es un fago templado que causa un ciclo lisogénico o lítico cuando infecta una bacteria. En su estado lítico, una vez que su genoma viral se inyecta en la célula huésped, se producen proteínas virales, se ensamblan los viriones y la célula huésped se lisa para liberar los fagos, continuando el ciclo. En el ciclo lisogénico, el genoma del fago se replica con el resto del genoma bacteriano y se transmite a las células hijas en cada división celular posterior. Puede pasar al ciclo lítico por un evento posterior, como la radiación ultravioleta o la inanición.
Los fagos como el fago lambda utilizan sus recombinasas específicas de sitio para integrar su ADN en el genoma del huésped durante la lisogenia. El ADN del fago P1, por otro lado, existe como un plásmido en el huésped. El sistema Cre-lox cumple varias funciones en el fago: circulariza el ADN del fago en un plásmido, separa los anillos de plásmido interconectados para que pasen a ambas bacterias hijas por igual y puede ayudar a mantener el número de copias a través de un medio alternativo de replicación. [36]
El ADN del fago P1, cuando se libera en el huésped desde el virión, tiene la forma de una molécula de ADN de doble hebra lineal. La enzima Cre se dirige a los sitios loxP en los extremos de esta molécula y cicla el genoma. Esto también puede tener lugar en ausencia del sistema Cre lox [37] con la ayuda de otras proteínas bacterianas y virales. El plásmido P1 es relativamente grande (≈90 Kbp) y, por lo tanto, existe en un número bajo de copias, generalmente una por célula. Si los dos plásmidos hijos se entrelazan, una de las células hijas del huésped perderá el plásmido. El sistema de recombinación Cre-lox previene estas situaciones al desvincular los anillos de ADN mediante la realización de dos eventos de recombinación (anillos enlazados -> anillo único fusionado -> dos anillos no enlazados). También se propone que la replicación del círculo rodante seguida de recombinación permitirá que el plásmido aumente su número de copias cuando ciertos reguladores (repA) sean limitantes. [36]
Implementación de múltiples pares de sitios loxP
Los investigadores han utilizado múltiples variantes de loxP, [38] en particular lox2272 y loxN, con la combinación de diferentes acciones Cre (transitorias o constitutivas) para crear un sistema " Brainbow " que permite la coloración múltiple del cerebro de los ratones con cuatro proteínas fluorescentes. .
Otro informe que usa dos pares de variantes lox pero mediante la regulación de la longitud del ADN en un par da como resultado la activación de genes estocásticos con un nivel regulado de escasez. [24]
notas y referencias
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enlaces externos
- Introducción a la tecnología Cre-lox por el "Laboratorio Jackson"