En biología molecular y biotecnología , una etiqueta fluorescente , también conocida como etiqueta fluorescente o sonda fluorescente , es una molécula que se une químicamente para ayudar en la detección de una biomolécula como una proteína, un anticuerpo o un aminoácido. Generalmente, el etiquetado fluorescente , o marcaje, utiliza un derivado reactivo de una molécula fluorescente conocida como fluoróforo . El fluoróforo se une selectivamente a una región específica o grupo funcional en la molécula diana y puede unirse química o biológicamente. [1] Varias técnicas de etiquetado, como el etiquetado enzimático,el etiquetado de proteínas y el etiquetado genético se utilizan ampliamente. El bromuro de etidio , la fluoresceína y la proteína verde fluorescente son etiquetas comunes. Las moléculas más comúnmente etiquetadas son anticuerpos, proteínas, aminoácidos y péptidos que luego se utilizan como sondas específicas para la detección de una diana en particular. [2]
Historia
El desarrollo de métodos para detectar e identificar biomoléculas ha sido motivado por la capacidad de mejorar el estudio de la estructura y las interacciones moleculares. Antes de la llegada del marcaje fluorescente, se usaban radioisótopos para detectar e identificar compuestos moleculares. Desde entonces, se han desarrollado métodos más seguros que implican el uso de tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes como etiquetas o sondas como medio para marcar e identificar biomoléculas. [3] Aunque el etiquetado fluorescente a este respecto solo se ha utilizado recientemente, el descubrimiento de la fluorescencia existe desde hace mucho más tiempo.
Sir George Stokes desarrolló la Ley de Fluorescencia de Stokes en 1852, que establece que la longitud de onda de la emisión de fluorescencia es mayor que la de la radiación excitante. Richard Meyer luego denominó fluoróforo en 1897 para describir un grupo químico asociado con la fluorescencia. Desde entonces, la fluoresceína fue creada como un tinte fluorescente por Adolph von Baeyer en 1871 y el método de tinción se desarrolló y utilizó con el desarrollo de la microscopía de fluorescencia en 1911. [4]
El bromuro de etidio y sus variantes se desarrollaron en la década de 1950, [4] y en 1994, se introdujeron las proteínas fluorescentes o FP. [5] La proteína verde fluorescente o GFP fue descubierta por Osamu Shimomura en la década de 1960 y fue desarrollada como una molécula trazadora por Douglas Prasher en 1987. [6] Los FP llevaron a un gran avance en la obtención de imágenes de células vivas con la capacidad de etiquetar selectivamente regiones de proteínas genéticas y observar las funciones y los mecanismos de las proteínas. [5] Por este avance, Shimomura recibió el Premio Nobel en 2008. [7]
Se han desarrollado nuevos métodos para rastrear biomoléculas, incluido el uso de biosensores colorimétricos, compuestos fotocrómicos, biomateriales y sensores electroquímicos. El etiquetado fluorescente también es un método común en el que las aplicaciones se han expandido al etiquetado enzimático, etiquetado químico, etiquetado de proteínas y etiquetado genético. [1]
Métodos para rastrear biomoléculas
Actualmente existen varios métodos de etiquetado para rastrear biomoléculas. Algunos de los métodos incluyen los siguientes.
Marcadores de isótopos
Las especies comunes para las que se utilizan los marcadores isotópicos incluyen proteínas. En este caso, los aminoácidos con isótopos estables de carbono, nitrógeno o hidrógeno se incorporan en las secuencias de polipéptidos. [8] Estos polipéptidos luego se someten a espectrometría de masas . Debido al cambio definido exacto que estos isótopos incurren en los péptidos, es posible decir a través del gráfico de espectrometría qué péptidos contenían los isótopos. Al hacerlo, se puede extraer la proteína de interés de varias otras en un grupo. Los compuestos isotópicos juegan un papel importante como fotocromos, que se describen a continuación.
Biosensores colorimétricos
Los biosensores están unidos a una sustancia de interés. Normalmente, esta sustancia no podría absorber la luz, pero con el biosensor adjunto, la luz se puede absorber y emitir en un espectrofotómetro . [9] Además, los biosensores fluorescentes se pueden ver a simple vista. Algunos biosensores fluorescentes también tienen la capacidad de cambiar de color en entornos cambiantes (por ejemplo, de azul a rojo). Un investigador podría inspeccionar y obtener datos sobre el entorno circundante en función del color que pudiera ver visiblemente de la especie híbrida biosensor-molécula. [10]
Los ensayos colorimétricos se utilizan normalmente para determinar cuánta concentración de una especie hay en relación con otra. [9]
Compuestos fotocromáticos
Los compuestos fotocromáticos tienen la capacidad de cambiar entre una gama o variedad de colores. Su capacidad para mostrar diferentes colores radica en cómo absorben la luz. Las diferentes manifestaciones isoméricas de la molécula absorben diferentes longitudes de onda de luz, por lo que cada especie isomérica puede mostrar un color diferente en función de su absorción. Estos incluyen compuestos fotoconmutables, que son proteínas que pueden cambiar de un estado no fluorescente a uno fluorescente en un entorno determinado. [11]
La molécula orgánica más común que se utiliza como fotocromo es el diarileteno . [12] Otros ejemplos de proteínas fotoconmutables incluyen PADRON-C, rs-FastLIME-s y bs-DRONPA-s, que se pueden usar en células de plantas y mamíferos por igual para observar cómo las células se mueven hacia diferentes entornos. [11]
Biomateriales
Los biomateriales fluorescentes son una posible forma de utilizar factores externos para observar una vía de forma más visible. El método implica marcar con fluorescencia moléculas de péptidos que alterarían la vía natural de un organismo. Cuando este péptido se inserta en la célula del organismo, puede inducir una reacción diferente. Este método se puede utilizar, por ejemplo, para tratar a un paciente y luego ver visiblemente el resultado del tratamiento. [13]
Sensores electroquímicos
Los sensores electroquímicos se pueden utilizar para la detección de biomoléculas sin etiquetas. Detectan cambios y miden la corriente entre un electrodo metálico con sonda y un electrolito que contiene el analito objetivo. A continuación, se aplica un potencial conocido al electrodo a partir de una corriente de retroalimentación y se puede medir la corriente resultante. Por ejemplo, una técnica que usa detección electroquímica incluye elevar lentamente el voltaje, lo que provoca que las especies químicas en el electrodo se oxiden o reduzcan. Se traza la corriente de la celda frente al voltaje, lo que finalmente puede identificar la cantidad de especies químicas consumidas o producidas en el electrodo. [14] Las etiquetas fluorescentes se pueden utilizar junto con sensores electroquímicos para facilitar la detección en un sistema biológico.
Etiquetas fluorescentes
De los diversos métodos de etiquetado de biomoléculas, los marcadores fluorescentes son ventajosos porque son muy sensibles incluso a baja concentración y no destruyen el plegamiento y la función de la molécula diana. [1]
La proteína verde fluorescente es una proteína fluorescente natural de la medusa Aequorea victoria que se usa ampliamente para marcar proteínas de interés. GFP emite un fotón en la región verde del espectro de luz cuando es excitado por la absorción de luz. El cromóforo consiste en un tripéptido oxidado -Ser ^ 65-Tyr ^ 66-Gly ^ 67 ubicado dentro de un barril β. GFP cataliza la oxidación y solo requiere oxígeno molecular. La GFP se ha modificado cambiando la longitud de onda de la luz absorbida para incluir otros colores de fluorescencia. YFP o proteína fluorescente amarilla , BFP o proteína fluorescente azul y CFP o proteína fluorescente cian son ejemplos de variantes de GFP. Estas variantes son producidas por la ingeniería genética del gen GFP. [15]
Las sondas fluorescentes sintéticas también se pueden utilizar como marcadores fluorescentes. Las ventajas de estas etiquetas incluyen un tamaño más pequeño con más variedad de colores. Pueden usarse para marcar proteínas de interés de forma más selectiva mediante varios métodos, incluido el marcaje basado en el reconocimiento químico, como el uso de etiquetas de péptidos quelantes de metales, y el marcaje basado en el reconocimiento biológico mediante reacciones enzimáticas. [16] Sin embargo, a pesar de su amplia gama de longitudes de onda de excitación y emisión, así como una mejor estabilidad, las sondas sintéticas tienden a ser tóxicas para la célula y, por lo tanto, no se utilizan generalmente en estudios de imágenes celulares. [1]
Los marcadores fluorescentes se pueden hibridar con ARNm para ayudar a visualizar la interacción y la actividad, como la localización del ARNm. Una hebra antisentido marcada con la sonda fluorescente se une a una única hebra de ARNm y luego se puede ver durante el desarrollo celular para ver el movimiento del ARNm dentro de la célula. [17]
Etiquetas fluorogénicas
Un fluorógeno es un ligando (ligando fluorogénico) que no es fluorescente en sí mismo, pero cuando está unido por una proteína específica o la estructura del ARN se vuelve fluorescente. [18]
Por ejemplo, FAST es una variante de la proteína amarilla fotoactiva que se diseñó para unir imitaciones químicas del cromóforo tripéptido GFP. [19] Del mismo modo, el aptámero de espinaca es una secuencia de ARN diseñada que puede unirse a imitadores químicos cromóforos de GFP, lo que confiere fluorescencia condicional y reversible a las moléculas de ARN que contienen la secuencia. [20]
Uso de etiquetas en etiquetado fluorescente
El etiquetado fluorescente es conocido por su naturaleza no destructiva y su alta sensibilidad. Esto lo ha convertido en uno de los métodos más utilizados para etiquetar y rastrear biomoléculas. [1] Se pueden utilizar varias técnicas de marcaje fluorescente dependiendo de la naturaleza del objetivo.
Etiquetado enzimático
En el marcaje enzimático, primero se forma una construcción de ADN, utilizando un gen y el ADN de una proteína fluorescente. [21] Después de la transcripción, se forma un ARN híbrido + fluorescente. El objeto de interés está unido a una enzima que puede reconocer este ADN híbrido. Normalmente se utiliza fluoresceína o biotina como fluoróforo.
Etiquetado químico
El marcaje químico o el uso de etiquetas químicas utiliza la interacción entre una molécula pequeña y una secuencia genética de aminoácidos específica. [22] En ocasiones, el etiquetado químico se utiliza como alternativa a las buenas prácticas agrarias. Las proteínas sintéticas que funcionan como sondas fluorescentes son más pequeñas que las GFP y, por lo tanto, pueden funcionar como sondas en una variedad más amplia de situaciones. Además, ofrecen una gama más amplia de colores y propiedades fotoquímicas. [23] Con los avances recientes en el etiquetado químico, las etiquetas químicas se prefieren a las proteínas fluorescentes debido a las limitaciones arquitectónicas y de tamaño del barril β característico de la proteína fluorescente. Las alteraciones de las proteínas fluorescentes conducirían a la pérdida de propiedades fluorescentes. [22]
Etiquetado de proteínas
El etiquetado de proteínas utiliza una etiqueta corta para minimizar la interrupción del plegamiento y la función de las proteínas. Los metales de transición se utilizan para unir residuos específicos en las etiquetas a dianas específicas del sitio, como los extremos N-terminales, C-terminales o sitios internos dentro de la proteína. Los ejemplos de etiquetas utilizadas para el etiquetado de proteínas incluyen etiquetas biarsenicales, etiquetas de histidina y etiquetas FLAG. [1]
Etiquetado genético
La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un ejemplo de una técnica de marcado genético que utiliza sondas que son específicas para sitios cromosómicos a lo largo de un cromosoma, también conocido como pintura cromosómica . Múltiples colorantes fluorescentes, cada uno de los cuales tiene una longitud de onda de excitación y emisión distinta, se unen a una sonda que luego se hibrida con los cromosomas. Un microscopio de fluorescencia puede detectar los tintes presentes y enviarlos a una computadora que puede revelar el cariotipo de una célula. Esta técnica permite revelar anomalías como deleciones y duplicaciones. [24]
Imágenes de células
Las etiquetas químicas se han diseñado para tecnologías de imagen más que las proteínas fluorescentes porque las etiquetas químicas pueden localizar los fotosensibilizadores más cerca de las proteínas diana. [25] Las proteínas entonces se puede marcar y se detectaron con imágenes tales como super-resolución microscopía , Ca 2+ -Imagenología , sensor de pH, la detección de peróxido de hidrógeno, cromóforo asistida inactivación luz, y microscopía de luz multi-fotón. Los estudios de imágenes in vivo en animales vivos se han realizado por primera vez con el uso de una proteína monomérica derivada de la haloalcano deshalogenasa bacteriana conocida como Halo-tag. [22] [26] La etiqueta Halo se une covalentemente a su ligando y permite una mejor expresión de proteínas solubles. [26]
Ventajas
Aunque los colorantes fluorescentes pueden no tener la misma sensibilidad que las sondas radiactivas, pueden mostrar la actividad en tiempo real de las moléculas en acción. [27] Además, la radiación y el manejo apropiado ya no son una preocupación.
Con el desarrollo del etiquetado fluorescente, la microscopía de fluorescencia ha permitido la visualización de proteínas específicas en imágenes de células vivas y fijas. La localización de proteínas específicas ha dado lugar a conceptos importantes en biología celular, como las funciones de distintos grupos de proteínas en las membranas y orgánulos celulares. En la obtención de imágenes de células vivas, las etiquetas fluorescentes permiten controlar los movimientos de las proteínas y sus interacciones. [24]
Los últimos avances en métodos que involucran etiquetas fluorescentes han llevado a la visualización de ARNm y su localización dentro de varios organismos. La formación de imágenes de células vivas de ARN se puede lograr mediante la introducción de ARN sintetizado que se acopla químicamente con una etiqueta fluorescente en las células vivas mediante microinyección. Esta técnica se utilizó para mostrar cómo el ARNm de oskar en el embrión de Drosophila se localiza en la región posterior del ovocito . [17]
Ver también
- Velocimetría de marcado molecular
- Espectrofotómetro para mediciones de ácidos nucleicos
- Etiquetas de proteína
Notas
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