El bromuro de etidio (o bromuro de homidio , [1] cloruro de sal cloruro de homidio ) [2] [3] es un agente intercalante comúnmente utilizado como etiqueta fluorescente ( tinción de ácido nucleico ) en laboratorios de biología molecular para técnicas como la electroforesis en gel de agarosa . Comúnmente se abrevia como EtBr , que también es una abreviatura de bromoetano . Para evitar confusiones, algunos laboratorios han utilizado la abreviatura EthBr para esta sal. Cuando se expone a la luz ultravioleta ,fluorescen con un color naranja, intensificándose casi 20 veces después de unirse al ADN . Bajo el nombre de homidium , se ha utilizado comúnmente desde la década de 1950 en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado. [4] La alta incidencia de resistencia a los antimicrobianos hace que este tratamiento no sea práctico en algunas áreas, donde en su lugar se usa el cloruro de isometamidio relacionado . El bromuro de etidio puede ser un mutágeno , aunque esto depende del organismo expuesto y las circunstancias de la exposición.
Nombres | |
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Nombre IUPAC Bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio | |
Otros nombres
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Identificadores | |
Modelo 3D ( JSmol ) | |
CHEBI | |
CHEMBL | |
ChemSpider | |
Tarjeta de información ECHA | 100.013.622 |
Número CE |
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KEGG | |
PubChem CID | |
Número RTECS |
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UNII | |
Tablero CompTox ( EPA ) | |
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Propiedades | |
C 21 H 20 BrN 3 | |
Masa molar | 394,294 g / mol |
Apariencia | Sólido rojo púrpura |
Punto de fusion | 260 a 262 ° C (500 a 504 ° F; 533 a 535 K) |
solubilidad en agua | ~ 40 g / l |
Farmacología | |
Código ATCvet | QP51AX06 ( OMS ) |
Peligros | |
Frases R (desactualizadas) | R25 R36 / 37/38 R46 |
Frases S (desactualizadas) | S22 S24 / 25 S26 S36 / 37/39 S45 S53 |
NFPA 704 (diamante de fuego) | 4 1 0 |
punto de inflamabilidad | > 100 ° C (212 ° F; 373 K) |
Salvo que se indique lo contrario, los datos se proporcionan para materiales en su estado estándar (a 25 ° C [77 ° F], 100 kPa). | |
verificar ( ¿qué es ?) | |
Referencias de Infobox | |
Estructura, química y fluorescencia
Como ocurre con la mayoría de los compuestos fluorescentes , el bromuro de etidio es aromático . Su resto heterocíclico central se conoce genéricamente como fenantridina , un isómero del cual es el colorante fluorescente acridina . Los máximos de absorción de EtBr en solución acuosa se encuentran a 210 nm y 285 nm, que corresponden a la luz ultravioleta . Como resultado de esta excitación , EtBr emite luz naranja con una longitud de onda de 605 nm. [5] [6]
La intensa fluorescencia del bromuro de etidio después de la unión con el ADN probablemente no se deba a la estabilización rígida del resto fenilo , porque se ha demostrado que el anillo de fenilo se proyecta fuera de las bases intercaladas. De hecho, se encuentra que el grupo fenilo es casi perpendicular al plano del sistema de anillos, ya que gira alrededor de su enlace sencillo para encontrar una posición en la que incidirá mínimamente sobre el sistema de anillos. En cambio, se cree que el entorno hidrófobo que se encuentra entre los pares de bases es el responsable . Al moverse hacia este ambiente hidrofóbico y alejarse del solvente, el catión etidio se ve obligado a desprenderse de las moléculas de agua que estaban asociadas con él. Como el agua es un extintor de fluorescencia muy eficaz , la eliminación de estas moléculas de agua permite que el etidio emita fluorescencia. [ cita requerida ]
Aplicaciones
El bromuro de etidio se usa comúnmente para detectar ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular. En el caso del ADN, normalmente se trata de ADN de doble hebra procedente de PCR , digestiones de restricción , etc. También se puede detectar el ARN de hebra sencilla , ya que normalmente se pliega sobre sí mismo y, por lo tanto, proporciona un emparejamiento local de bases para que el colorante se intercale. La detección generalmente implica un gel que contiene ácidos nucleicos colocado sobre o debajo de una lámpara ultravioleta. Dado que la luz ultravioleta es dañina para los ojos y la piel, los geles teñidos con bromuro de etidio generalmente se ven indirectamente usando una cámara cerrada, con las imágenes fluorescentes registradas como fotografías. Cuando se necesite una visión directa, se deben proteger los ojos y la piel expuesta del espectador. En el laboratorio, las propiedades de intercalación se han utilizado durante mucho tiempo para minimizar la condensación cromosómica cuando un cultivo se expone a agentes de detención mitótica durante la cosecha. Las preparaciones de portaobjetos resultantes permiten un mayor grado de resolución y, por lo tanto, más confianza para determinar la integridad estructural de los cromosomas tras el análisis microscópico.
El bromuro de etidio también se utiliza durante la separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa . [7] Se agrega al búfer de ejecución y se une intercalando entre pares de bases de ADN. Cuando el gel de agarosa se ilumina con luz ultravioleta, las bandas de ADN se vuelven visibles. La intercalación de EtBr puede alterar las propiedades de la molécula de ADN, como la carga, el peso, la conformación y la flexibilidad. Dado que las movilidades de las moléculas de ADN a través del gel de agarosa se miden en relación con un estándar de peso molecular, los efectos de EtBr pueden ser críticos para determinar los tamaños de las moléculas. [8]
El bromuro de etidio también se ha utilizado ampliamente para reducir el número de copias de ADN mitocondrial en células en proliferación. [9] El efecto de EtBr sobre el ADN mitocondrial se utiliza en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado, ya que EtBr une moléculas de ADN de cinetoplasto y cambia su conformación a la forma Z-ADN . Esta forma inhibe la replicación del ADN de cinetoplastido, que es letal para los tripanosomas. [10]
La sal de cloruro cloruro de homidio tiene las mismas aplicaciones. [2] [3]
Alternativas
Existen alternativas al bromuro de etidio que se anuncian como menos peligrosas y con mejor rendimiento. [11] [12] Por ejemplo, algunos investigadores utilizan varios tintes basados en SYBR y hay otras manchas emergentes como "Novel Juice". Los colorantes SYBR son menos mutagénicos que el EtBr según la prueba de Ames con extracto de hígado. [13] Sin embargo, se descubrió que SYBR Green I era más mutagénico que EtBr para las células bacterianas expuestas a los rayos UV (que se utilizan para visualizar cualquiera de los dos tintes). [14] Este puede ser el caso de otros colorantes "más seguros", pero aunque se dispone de detalles sobre mutagénicos y toxicidad [15], estos no se han publicado en revistas revisadas por pares. La MSDS para SYBR Safe informa un LD 50 para ratas de más de 5 g / kg, que es más alto que el de EtBr (1,5 g / kg). Muchos tintes alternativos están suspendidos en DMSO , que tiene sus propias implicaciones para la salud, incluida una mayor absorción cutánea de compuestos orgánicos. [13] A pesar de la ventaja de rendimiento de usar tintes SYBR en lugar de EtBr para fines de tinción, muchos investigadores todavía prefieren EtBr ya que es considerablemente menos costoso.
Riesgos de salud
Se cree que el bromuro de etidio actúa como mutágeno porque intercala el ADN de doble hebra (es decir, se inserta entre las hebras), deformando el ADN. [16] Esto podría afectar los procesos biológicos del ADN, como la replicación y la transcripción del ADN . Se ha demostrado que el bromuro de etidio es mutagénico para las bacterias a través de la prueba de Ames , pero solo después del tratamiento con homogeneizado de hígado, que simula la degradación metabólica de la molécula que se está probando. [17] La falta de mutagenicidad detectada sin homogeneizado de hígado indica que el bromuro de etidio no es directamente mutagénico, pero que sus metabolitos sí lo son; sin embargo, se desconoce la identidad de estos metabolitos mutagénicos. El Programa Nacional de Toxicología establece que no es mutagénico en ratas y ratones. [18] Estas conclusiones están respaldadas por un estudio de carcinogenicidad subcrónica en ratones, en el que no se detectaron efectos mutagénicos. [19] El uso de bromuro de etidio (marca Homidium) en animales para tratar la infección por tripanosomas sugiere que la toxicidad y mutagenicidad no son altas. Se han realizado estudios en animales para evaluar EtBr como un agente quimioterapéutico antitumoral potencial. [20] Su uso quimioterapéutico se debe a su toxicidad para las mitocondrias. [21] Un estudio más reciente muestra que EtBr actúa como un veneno de topoisomerasa I, al igual que varios medicamentos contra el cáncer utilizados en humanos. [22] Los estudios anteriores no apoyan la idea común de que el bromuro de etidio es un potente mutágeno en los seres humanos, pero sí indican que puede ser tóxico a altas concentraciones. Los escritores científicos recientes han informado sobre lo que se percibe como un temor desproporcionado sobre la toxicidad y mutagenicidad del compuesto. [23] [24]
La mayor parte del uso de bromuro de etidio en el laboratorio (0,25–1 µg / ml) está por debajo del nivel requerido para la toxicidad y es 3 órdenes de magnitud más bajo que las dosis terapéuticas utilizadas en el ganado. [25] El nivel es lo suficientemente alto como para que la exposición pueda interferir con la replicación del ADN mitocondrial en algunas líneas celulares humanas, aunque las implicaciones de eso no están claras. Se necesitarían pruebas en humanos y estudios más prolongados en cualquier sistema de mamíferos para comprender completamente el riesgo potencial que representa el bromuro de etidio para los trabajadores de laboratorio. [26]
Puede añadirse bromuro de etidio a los medios YPD y utilizarse como inhibidor del crecimiento celular. [27]
Manipulación y eliminación
El bromuro de etidio no está regulado como residuo peligroso en concentraciones bajas, [28] pero muchas organizaciones lo tratan como residuo peligroso. El material debe manipularse de acuerdo con la hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
La eliminación del bromuro de etidio de laboratorio sigue siendo un tema controvertido. [29] El bromuro de etidio puede degradarse químicamente o recogerse e incinerarse. Es común que los desechos de bromuro de etidio por debajo de una concentración obligatoria se eliminen normalmente (como verterlos por un desagüe). Una práctica común es tratar el bromuro de etidio con hipoclorito de sodio (lejía) antes de desecharlo. [30] Según Lunn y Sansone, la degradación química con lejía produce compuestos que son mutagénicos según la prueba de Ames . Faltan datos sobre los efectos mutagénicos de los productos de degradación. Lunn y Sansone describen métodos de degradación más eficaces. [31] En otros lugares, se recomienda la eliminación del bromuro de etidio de las soluciones con carbón activado o resina de intercambio iónico . [32] Hay varios productos comerciales disponibles para este uso. [33]
Resistencia a las drogas
Los tripanosomas en el valle del río Gibe en el suroeste de Etiopía mostraron resistencia universal entre julio de 1989 y febrero de 1993. [34] Esto probablemente indica una pérdida permanente de función en esta área contra el objetivo probado, T. congolense aislado de ganado borano . [34]
Ver también
- Fenantridina
- Electroforesis en gel de agarosa y electroforesis en gel de ácidos nucleicos
- GelRed (derivado de ethbr) y GelGreen , comercializados como tinciones de ADN más seguras e intensas
- Yoduro de propidio y monoazida de propidio , colorantes relacionados
Referencias
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enlaces externos
- Medios relacionados con el bromuro de etidio en Wikimedia Commons