La endonucleasa de restricción Fok 1 , que se encuentra naturalmente en Flavobacterium okeanokoites , es una endonucleasa de restricción bacteriana de tipo IIS que consta de un dominio de unión al ADN N-terminal y un dominio de escisión de ADN no específico en el C-terminal . [2] Una vez que la proteína se une al ADN dúplex a través de su dominio de unión al ADN en el sitio de reconocimiento 5'-GGATG-3 ' , el dominio de escisión del ADN se activa y escinde, sin mayor especificidad de secuencia, la primera hebra 9 nucleótidos corriente abajo y la segunda hebra 13 nucleótidos corriente arriba del nucleótido más cercano del sitio de reconocimiento.[3]
Endonucleasa de restricción Fok 1, C terminal | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | Endonuc- Fok 1_C | |||||||
Pfam | PF09254 | |||||||
Clan pfam | CL0415 | |||||||
InterPro | IPR015334 | |||||||
SCOP2 | 2fok / SCOPe / SUPFAM | |||||||
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Su masa molecular es de 65,4 kDa, estando compuesta por 587 aminoácidos.
Dominio de unión al ADN
El dominio de reconocimiento contiene tres subdominios (D1, D2 y D3) que están relacionados evolutivamente con el dominio de unión al ADN de la proteína activadora del gen catabolito que contiene una hélice-vuelta-hélice. [3]
Dominio de escisión de ADN
La escisión del ADN está mediada por el dominio de escisión no específico que también incluye la superficie de dimerización. [4] La interfaz del dímero está formada por las hélices paralelas α4 y α5 y dos bucles P1 y P2 del dominio de escisión. [3]
Actividad
Cuando la nucleasa no se une al ADN, el dominio de endonucleasa es secuestrado por el dominio de unión al ADN y se libera a través de un cambio conformacional en el dominio de unión al ADN al unirse a su sitio de reconocimiento. La escisión solo se produce tras la dimerización, cuando el dominio de reconocimiento está unido a su sitio afín y en presencia de iones magnesio. [4]
Explotación
El dominio de endonucleasa de Fok1 se ha utilizado en varios estudios, después de la combinación con una variedad de dominios de unión al ADN , como el dedo de zinc (ver nucleasa de dedo de zinc ), [2] o Cas9 inactivo [5] [6] [7]
Una de varias variantes del gen del receptor de vitamina D humano está causada por un polimorfismo de un solo nucleótido en el codón de inicio del gen que puede distinguirse mediante el uso de la enzima Fok1. [8]
Referencias
- ^ Aggarwal, AK; Wah, DA; Hirsch, JA; Dorner, LF; Schildkraut, I. (1997). "Estructura de la endonucleasa multimodular Fok1 unida al ADN". Naturaleza . 388 (6637): 97–100. doi : 10.1038 / 40446 . PMID 9214510 .
- ^ a b Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus M, Chandrasegaran S (2005). "Nucleasas de dedos de zinc: tijeras moleculares de diseño personalizado para la ingeniería del genoma de células de plantas y mamíferos" . Ácidos nucleicos Res . 33 (18): 5978–90. doi : 10.1093 / nar / gki912 . PMC 1270952 . PMID 16251401 .
- ^ a b c Wah, DA; Bitinaite, J .; Schildkraut, I .; Aggarwal, AK (1998). "La estructura de Fok1 tiene implicaciones para la escisión del ADN" . Proc Natl Acad Sci USA . 95 (18): 10564–9. doi : 10.1073 / pnas.95.18.10564 . PMC 27934 . PMID 9724743 .
- ^ a b Bitinaite, J .; Wah, DA; Aggarwal, AK; Schildkraut, I. (1998). "La dimerización de Fok1 es necesaria para la escisión del ADN" . Proc Natl Acad Sci USA . 95 (18): 10570–5. doi : 10.1073 / pnas.95.18.10570 . PMC 27935 . PMID 9724744 .
- ^ Tsai, SQ y col. (2014). Nucleasas diméricas de Fok1 guiadas por ARN CRISPR para la edición genómica altamente específica. Nature Biotechnol. 32, 569–576 doi : 10.1038 / nbt.2908
- ^ Guilinger, JP, Thompson, DB y Liu, DR (2014). La fusión de Cas9 catalíticamente inactiva con nucleasa Fok1 mejora la especificidad de la modificación del genoma. Nature Biotechnol. 32, 577–582 doi : 10.1038 / nbt.2909
- ^ Wyvekens, N., Topkar, VV, Khayter, C., Joung, JK y Tsai, SQ (2015). Nucleasas Fok1-dCas9 guiadas por ARN CRISPR dimérico dirigidas por ARNg truncados para la edición del genoma altamente específica. Tararear. Gene Ther. 26, 425–431 doi : 10.1089 / hum.2015.084
- ^ Strandberg, S .; et al. (2003). "El polimorfismo del codón de inicio del receptor de vitamina D (Fok1) está relacionado con la densidad mineral ósea en adolescentes sanos". J Bone Miner Metab . 21 (2): 109-13. doi : 10.1007 / s007740300018 . PMID 12601576 .
Ver también
- Ingeniería de proteínas
- Ingeniería genética
- Nucleasa de dedos de zinc