Edición del genoma

Tipo de ingeniería genética

Las diferentes generaciones de nucleasas utilizadas para la edición del genoma y las vías de reparación del ADN utilizadas para modificar el ADN diana.

La edición del genoma , o la ingeniería del genoma , o la edición de genes , es un tipo de ingeniería genética en la que el ADN se inserta, elimina, modifica o reemplaza en el genoma de un organismo vivo. A diferencia de las primeras técnicas de ingeniería genética que insertaban material genético al azar en el genoma de un huésped, la edición del genoma apunta a las inserciones en lugares específicos.

Historia

La edición del genoma fue pionera en la década de 1990, ^[1] antes del advenimiento de las actuales plataformas de edición de genes basadas en nucleasas, sin embargo, su uso se vio limitado por las bajas eficiencias de edición. La edición del genoma con nucleasas modificadas genéticamente, es decir, las tres clases principales de estas enzimas, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) y meganucleasas modificadas genéticamente, fueron seleccionadas por Nature Methods como el Método del año 2011. ^[2] El sistema CRISPR-Cas fue seleccionado por Science como Avance del año 2015. ^[3]

A partir de 2015 se utilizaron cuatro familias de nucleasas diseñadas: meganucleasas , nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN) y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas ( CRISPR / Cas9 ). ^{[4] [5] [6] [7]} Nueve editores de genoma estaban disponibles en 2017. ^[8]

En 2018, los métodos comunes para dicha edición utilizaron nucleasas diseñadas o "tijeras moleculares". Estas nucleasas crean roturas de doble hebra (DSB) específicas del sitio en las ubicaciones deseadas del genoma. Las roturas de doble cadena inducidas se reparan mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o recombinación homóloga (HR), lo que da como resultado mutaciones dirigidas ("ediciones").

En mayo de 2019, abogados en China informaron, a la luz de la supuesta creación por el científico chino He Jiankui de los primeros humanos editados genéticamente (ver la controversia de Lulu y Nana ), la redacción de regulaciones que cualquier persona que manipule el genoma humano mediante técnicas de edición genética , como CRISPR , sería responsable de cualquier consecuencia adversa relacionada. ^[9] Recientemente se ha discutido una perspectiva cautelosa sobre los posibles puntos ciegos y riesgos de CRISPR y biotecnologías relacionadas, ^[10] centrándose en la naturaleza estocástica de los procesos de control celular.

En febrero de 2020, un ensayo en EE. UU. Mostró de forma segura la edición del gen CRISPR en 3 pacientes con cáncer. ^[11]

Antecedentes

La ingeniería genética como método para introducir nuevos elementos genéticos en organismos existe desde la década de 1970. Un inconveniente de esta tecnología ha sido la naturaleza aleatoria con la que se inserta el ADN en el genoma del huésped , lo que puede dañar o alterar otros genes dentro del organismo. Aunque, se han descubierto varios métodos que dirigen los genes insertados a sitios específicos dentro del genoma de un organismo. ^[1] También ha permitido la edición de secuencias específicas dentro de un genoma, así como la reducción de efectos fuera del objetivo. Esto podría usarse con fines de investigación, dirigiendo mutaciones a genes específicos y en terapia génica.. Insertando un gen funcional en un organismo y dirigiéndolo a reemplazar el defectuoso, podría ser posible curar ciertas enfermedades genéticas .

Orientación genética

Recombinación homóloga

Los primeros métodos para dirigir genes a ciertos sitios dentro de un genoma de un organismo (llamados genes dirigidos ) se basaban en la recombinación homóloga (HR). ^[12] Al crear construcciones de ADN que contienen una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de HR dentro de la célula inserten la construcción en la ubicación deseada. El uso de este método en células madre embrionarias condujo al desarrollo de ratones transgénicos con genes específicos eliminados . También ha sido posible introducir genes o alterar los patrones de expresión génica . ^[13]En reconocimiento a su descubrimiento de cómo se puede utilizar la recombinación homóloga para introducir modificaciones genéticas en ratones a través de células madre embrionarias, Mario Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 . ^[14]

Orientación condicional

Si se elimina un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes se utilizaron recombinasas específicas de sitio (SSR). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-LoxP y Flp-FRT . Cre recombinasa es una enzima que elimina el ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de manera similar, con la recombinasa Flip reconociendo las secuencias de FRT. Cruzando un organismo que contiene los sitios de recombinasa que flanquean el gen de interés con un organismo que expresa la SSR bajo el control de promotores específicos de tejido, es posible anular o activar genes solo en determinadas células. Estas técnicas también se utilizaron para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Las modificaciones adicionales de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación solo bajo ciertas condiciones, permitiendo que los genes fueran eliminados o expresados ​​en momentos o etapas de desarrollo deseados . ^[13]

Proceso

Reparación de rotura de doble hilo

Una forma común de edición del genoma se basa en el concepto de mecánica de reparación de rotura de doble hebra del ADN (DSB). Hay dos vías principales que reparan el DSB; Unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ usa una variedad de enzimas para unir directamente los extremos del ADN, mientras que el HDR más preciso usa una secuencia homóloga como plantilla para la regeneración de las secuencias de ADN faltantes en el punto de ruptura. Esto se puede aprovechar creando un vector con los elementos genéticos deseados dentro de una secuencia que sea homóloga.a las secuencias flanqueantes de un DSB. Esto dará como resultado que se inserte el cambio deseado en el sitio del DSB. Si bien la edición de genes basada en HDR es similar a la selección de genes basada en recombinación homóloga, la tasa de recombinación aumenta en al menos tres órdenes de magnitud. ^[15]

Nucleasas diseñadas

Grupos de nucleasas modificadas genéticamente. Los colores coincidentes significan patrones de reconocimiento de ADN

La clave para la edición del genoma es crear un DSB en un punto específico dentro del genoma. Las enzimas de restricción comúnmente utilizadas son efectivas para cortar el ADN, pero generalmente reconocen y cortan en múltiples sitios. Para superar este desafío y crear DSB específico para un sitio, hasta la fecha se han descubierto y modificado mediante bioingeniería tres clases distintas de nucleasas. Estas son las nucleasas de dedo de zinc (ZFN), nucleasas efectoras como efectoras de la transcripción ( TALEN ), meganucleasas y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas ( CRISPR / Cas9).

Meganucleasas

Las meganucleasas , descubiertas a finales de los 80, son enzimas de la familia de las endonucleasas que se caracterizan por su capacidad para reconocer y cortar grandes secuencias de ADN (de 14 a 40 pares de bases). ^[16] Las meganucleasas más difundidas y conocidas son las proteínas de la familia LAGLIDADG, que deben su nombre a una secuencia de aminoácidos conservada .

Las meganucleasas, que se encuentran comúnmente en especies microbianas, tienen la propiedad única de tener secuencias de reconocimiento muy largas (> 14 pb), lo que las hace naturalmente muy específicas. ^{[17] [18]} Sin embargo, prácticamente no hay posibilidad de encontrar la meganucleasa exacta necesaria para actuar sobre una secuencia de ADN específica elegida. Para superar este desafío, se han utilizado métodos de detección de mutagénesis y de alto rendimiento para crear variantes de meganucleasa que reconocen secuencias únicas. ^{[18] [19]} Otros han podido fusionar varias meganucleasas y crear enzimas híbridas que reconocen una nueva secuencia. ^{[20] [21]}Sin embargo, otros han intentado alterar los aminoácidos de la meganucleasa que interactúan con el ADN para diseñar meganucelasas específicas de secuencia en un método denominado meganucleasa de diseño racional. ^[22] Otro enfoque implica el uso de modelos informáticos para intentar predecir con la mayor precisión posible la actividad de las meganucleasas modificadas y la especificidad de la secuencia nucleica reconocida. ^[23]

Se ha creado un gran banco que contiene varias decenas de miles de unidades de proteínas. Estas unidades se pueden combinar para obtener meganucleasas quiméricas que reconocen el sitio objetivo, proporcionando así herramientas de investigación y desarrollo que satisfacen una amplia gama de necesidades (investigación fundamental, salud, agricultura, industria, energía, etc.). Estas incluyen la producción a escala industrial. de dos meganucleasas capaces de escindir el gen XPC humano; las mutaciones en este gen dan como resultado Xeroderma pigmentosum , un trastorno monogénico grave que predispone a los pacientes al cáncer de piel y quema cuando su piel está expuesta a los rayos ultravioleta. ^[24]

Las meganucleasas tienen el beneficio de causar menos toxicidad en las células que los métodos como la nucleasa de dedos de zinc (ZFN), probablemente debido a un reconocimiento de secuencia de ADN más estricto; ^[18] sin embargo, la construcción de enzimas específicas de secuencia para todas las secuencias posibles es costosa y requiere mucho tiempo, ya que uno no se beneficia de las posibilidades combinatorias que utilizan métodos como las ZFN y las fusiones basadas en TALEN.

Nucleasas de dedos de zinc

A diferencia de las meganucleasas, el concepto detrás de las ZFN y la tecnología TALEN se basa en un dominio catalítico de corte de ADN no específico, que luego se puede vincular a una secuencia de ADN específica que reconoce péptidos como dedos de zinc y efectores similares a activadores de la transcripción (TALE). ^[25] El primer paso para esto fue encontrar una endonucleasa cuyo sitio de reconocimiento de ADN y sitio de escisión estuvieran separados entre sí, una situación que no es la más común entre las enzimas de restricción. ^[25] Una vez que se encontró esta enzima, su porción de escisión podría separarse, lo que sería muy inespecífico ya que no tendría capacidad de reconocimiento. Esta porción podría luego unirse a péptidos de reconocimiento de secuencias que podrían conducir a una especificidad muy alta.

Los motivos de dedos de zinc se producen en varios factores de transcripción . El ion zinc, que se encuentra en el 8% de todas las proteínas humanas, juega un papel importante en la organización de su estructura tridimensional. En los factores de transcripción, se localiza con mayor frecuencia en los sitios de interacción proteína-ADN, donde estabiliza el motivo. La parte C-terminal de cada dedo es responsable del reconocimiento específico de la secuencia de ADN.

Las secuencias reconocidas son cortas, compuestas por alrededor de 3 pares de bases, pero combinando de 6 a 8 dedos de zinc cuyos sitios de reconocimiento se han caracterizado, es posible obtener proteínas específicas para secuencias de alrededor de 20 pares de bases. Por tanto, es posible controlar la expresión de un gen específico. Se ha demostrado que esta estrategia se puede utilizar para promover un proceso de angiogénesis en animales. ^[26] También es posible fusionar una proteína construida de esta manera con el dominio catalítico de una endonucleasa para inducir una ruptura del ADN dirigida y, por lo tanto, utilizar estas proteínas como herramientas de ingeniería del genoma. ^[27]

El método generalmente adoptado para esto implica asociar dos proteínas de unión al ADN, cada una de las cuales contiene de 3 a 6 dedos de zinc elegidos específicamente, con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI que necesita dimerizar para escindir el ADN de doble hebra. Las dos proteínas reconocen dos secuencias de ADN que están separadas por unos pocos nucleótidos. La vinculación de las dos proteínas con dedos de zinc a sus respectivas secuencias acerca los dos dominios FokI. FokI requiere dimerización para tener actividad nucleasa y esto significa que la especificidad aumenta drásticamente ya que cada pareja nucleasa reconocería una secuencia de ADN única. Para mejorar este efecto, se han diseñado nucleasas FokI que solo pueden funcionar como heterodímeros. ^[28]

Se utilizan varios enfoques para diseñar nucleasas de dedos de zinc específicas para las secuencias elegidas. El más extendido consiste en combinar unidades de dedos de zinc con especificidades conocidas (montaje modular). Se han desarrollado diversas técnicas de selección, utilizando bacterias, levaduras o células de mamíferos, para identificar las combinaciones que ofrecen la mejor especificidad y la mejor tolerancia celular. Aunque no se ha informado de la caracterización directa de todo el genoma de la actividad de nucleasa con dedos de zinc, un ensayo que mide el número total de roturas de ADN de doble hebra en las células encontró que solo una o dos de estas roturas ocurren por encima del fondo en células tratadas con nucleasas con dedos de zinc con un sitio de reconocimiento compuesto de 24 pb y dominios de nucleasa FokI heterodímeros obligados . ^[28]

Las nucleasas de funcionamiento heterodímero evitarían la posibilidad de actividad homodímera no deseada y, por tanto, aumentarían la especificidad del DSB. Aunque las porciones de nucleasa de las construcciones de ZFN y TALEN tienen propiedades similares, la diferencia entre estas nucleasas modificadas está en su péptido de reconocimiento de ADN. Los ZFN se basan en los dedos de zinc Cys2-His2 y las construcciones TALEN en los TALE. Ambos dominios peptídicos que reconocen ADN tienen la característica de que se encuentran naturalmente en combinaciones en sus proteínas. Los dedos de zinc Cys2-His2 ocurren típicamente en repeticiones que están separadas por 3 pb y se encuentran en diversas combinaciones en una variedad de proteínas que interactúan con ácidos nucleicos, como los factores de transcripción.. Cada dedo del dominio del dedo de zinc es completamente independiente y la capacidad de unión de un dedo se ve afectada por su vecino. Los TALE, por otro lado, se encuentran en repeticiones con una relación de reconocimiento uno a uno entre los aminoácidos y los pares de nucleótidos reconocidos. Debido a que tanto los dedos de zinc como los TALE ocurren en patrones repetidos, se pueden probar diferentes combinaciones para crear una amplia variedad de especificidades de secuencia. ^[17]Los dedos de zinc se han establecido más en estos términos y enfoques como el ensamblaje modular (donde los dedos de zinc correlacionados con una secuencia de triplete se unen en una fila para cubrir la secuencia requerida), ABIERTO (selección de dominios peptídicos de baja rigurosidad frente a nucleótidos triplete seguida mediante selecciones de alta rigurosidad de la combinación de péptidos frente a la diana final en sistemas bacterianos), y se ha utilizado el cribado bacteriano de un híbrido de bibliotecas de dedos de zinc, entre otros métodos, para producir nucleasas específicas de sitio.

Las nucleasas de dedos de zinc son herramientas de investigación y desarrollo que ya se han utilizado para modificar una variedad de genomas, en particular por los laboratorios del Consorcio de dedos de zinc. La empresa estadounidense Sangamo BioSciences utiliza nucleasas de dedos de zinc para realizar investigaciones sobre la ingeniería genética de células madre y la modificación de células inmunes con fines terapéuticos. ^{[29] [30]} Los linfocitos T modificados se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase I para tratar un tipo de tumor cerebral (glioblastoma) y en la lucha contra el SIDA. ^[28]

TALEN

Descripción general del proceso TALEN

Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) son proteínas de unión al ADN específicas que presentan una matriz de repeticiones de 33 o 34 aminoácidos. Las TALEN son enzimas de restricción artificiales diseñadas mediante la fusión del dominio de corte de ADN de una nucleasa con los dominios TALE, que se pueden adaptar para reconocer específicamente una secuencia de ADN única. Estas proteínas de fusión sirven como "tijeras de ADN" fácilmente dirigibles para aplicaciones de edición de genes que permiten realizar modificaciones genómicas específicas como la inserción, deleción, reparación y reemplazo de secuencias en células vivas. ^[31] Los dominios de unión al ADN, que pueden diseñarse para unirse a cualquier secuencia de ADN deseada, provienen de los efectores de TAL , proteínas de unión al ADN excretadas por la aplicación Xanthomanos, patógena de plantas .Los efectores TAL constan de dominios repetidos, cada uno de los cuales contiene una secuencia altamente conservada de 34 aminoácidos, y reconocen un solo nucleótido de ADN dentro del sitio diana. La nucleasa puede crear roturas de doble hebra en el sitio objetivo que pueden repararse mediante uniones de extremos no homólogos propensos a errores(NHEJ), lo que resulta en alteraciones genéticas a través de la introducción de pequeñas inserciones o deleciones. Cada repetición se conserva, con la excepción de los denominados residuos variables de repetición (RVD) en las posiciones de aminoácidos 12 y 13. Los RVD determinan la secuencia de ADN a la que se unirá el TALE. Esta simple correspondencia uno a uno entre las repeticiones de TALE y la secuencia de ADN correspondiente hace que el proceso de ensamblar matrices de repeticiones para reconocer nuevas secuencias de ADN sea sencillo. Estos TALE se pueden fusionar al dominio catalítico de una ADN nucleasa, FokI, para generar una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN). Las construcciones de TALEN resultantes combinan especificidad y actividad, generando de manera efectiva nucleasas específicas de secuencia diseñadas que se unen y escinden secuencias de ADN solo en sitios preseleccionados.El sistema de reconocimiento de objetivos TALEN se basa en un código fácil de predecir. Las nucleasas TAL son específicas de su objetivo debido en parte a la longitud de su sitio de unión de más de 30 pares de bases. TALEN se puede realizar dentro de un rango de 6 pares de bases de cualquier nucleótido individual en todo el genoma.^[32]

Las construcciones TALEN se utilizan de manera similar a las nucleasas con dedos de zinc diseñadas y tienen tres ventajas en la mutagénesis dirigida: (1) la especificidad de unión al ADN es mayor, (2) los efectos fuera del objetivo son menores y (3) la construcción de la unión al ADN dominios es más fácil.

CRISPR

Artículo principal: edición de genes CRISPR

Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) son elementos genéticos que las bacterias utilizan como una especie de inmunidad adquirida para protegerse contra los virus. Consisten en secuencias cortas que se originan a partir de genomas virales y se han incorporado al genoma bacteriano. Cas (proteínas asociadas a CRISPR) procesa estas secuencias y corta secuencias de ADN viral coincidentes. Introduciendo plásmidos que contienen genes Cas y CRISPR específicamente construidos en células eucariotas, el genoma eucariota puede cortarse en cualquier posición deseada. ^[33]

Edición por modificación de Nucleobase (Edición BASE)

Uno de los primeros métodos de edición eficaz de ácidos nucleicos emplea enzimas modificadoras de bases nucleicas dirigidas por secuencias guía de ácidos nucleicos, que se describió por primera vez en la década de 1990 y ha experimentado un resurgimiento más recientemente. ^{[1] [34] [35] [36]} Este método tiene la ventaja de que no requiere romper las cadenas de ADN genómico y, por lo tanto, evita la inserción aleatoria y las deleciones asociadas con la rotura de las cadenas de ADN. Solo es apropiado para la edición precisa que requiere cambios de un solo nucleótido y se ha encontrado que es muy eficiente para este tipo de edición. ^[36]

Precisión y eficiencia de nucleasas diseñadas

El método de edición de genes de meganucleasas es el menos eficaz de los métodos mencionados anteriormente. Debido a la naturaleza de su elemento de unión al ADN y el elemento de escisión, se limita a reconocer un objetivo potencial cada 1000 nucleótidos. ^[7] ZFN se desarrolló para superar las limitaciones de la meganucleasa. El número de posibles dianas que ZFN puede reconocer se incrementó a uno de cada 140 nucleótidos. ^[7] Sin embargo, ambos métodos son impredecibles debido a que sus elementos de unión al ADN se afectan entre sí. Como resultado, se requieren altos grados de experiencia y procesos de validación largos y costosos.

Las nucleasas TALE, que son el método más preciso y específico, producen una mayor eficiencia que los dos métodos anteriores. Logra tal eficiencia porque el elemento de unión al ADN consiste en una matriz de subunidades TALE, cada una de las cuales tiene la capacidad de reconocer una cadena de nucleótidos de ADN específica independiente de otras, lo que da como resultado un mayor número de sitios diana con alta precisión. La creación de nuevas nucleasas TALE lleva alrededor de una semana y unos pocos cientos de dólares, con experiencia específica en biología molecular e ingeniería de proteínas. ^[7]

Las nucleasas CRISPR tienen una precisión ligeramente menor en comparación con las nucleasas TALE. Esto se debe a la necesidad de tener un nucleótido específico en un extremo para producir el ARN guía que CRISPR utiliza para reparar la rotura de doble hebra que induce. Se ha demostrado que es el método más rápido y económico, solo cuesta menos de doscientos dólares y unos pocos días de tiempo. ^[7] CRISPR también requiere la menor cantidad de experiencia en biología molecular, ya que el diseño se basa en el ARN guía en lugar de las proteínas. Una ventaja importante que tiene CRISPR sobre los métodos ZFN y TALEN es que puede dirigirse a diferentes secuencias de ADN utilizando sus sgRNA CRISPR de ~ 80 nt, mientras que los métodos ZFN y TALEN requieren la construcción y prueba de las proteínas creadas para dirigirse a cada secuencia de ADN. ^[37]

Debido a que la actividad fuera del objetivo de una nucleasa activa tendría consecuencias potencialmente peligrosas a nivel genético y orgánico, la precisión de las fusiones basadas en meganucleasas, ZFN, CRISPR y TALEN ha sido un área activa de investigación. Si bien se han informado cifras variables, las ZFN tienden a tener más citotoxicidad que los métodos TALEN o las nucleasas guiadas por ARN, mientras que los enfoques guiados por TALEN y ARN tienden a tener la mayor eficiencia y menos efectos fuera del objetivo. ^[38] Con base en la distancia teórica máxima entre la unión del ADN y la actividad nucleasa, los enfoques de TALEN dan como resultado la mayor precisión. ^[7]

Ingeniería genómica automatizada multiplex (MAGE)

El ADN sintético se introduce repetidamente en múltiples áreas diana del cromosoma y / o loci y luego se replica produciendo células con / sin mutaciones.

Los métodos para científicos e investigadores que deseaban estudiar la diversidad genómica y todos los posibles fenotipos asociados eran muy lentos, costosos e ineficientes. Antes de esta nueva revolución, los investigadores tendrían que hacer manipulaciones de un solo gen y ajustar el genoma una pequeña sección a la vez, observar el fenotipo y comenzar el proceso de nuevo con una manipulación diferente de un solo gen. ^[39]Por lo tanto, investigadores del Instituto Wyss de la Universidad de Harvard diseñaron MAGE, una poderosa tecnología que mejora el proceso de edición del genoma in vivo. Permite manipulaciones rápidas y eficientes de un genoma, todo en una máquina lo suficientemente pequeña como para colocarla encima de una pequeña mesa de cocina. Esas mutaciones se combinan con la variación que ocurre naturalmente durante la mitosis celular creando miles de millones de mutaciones celulares.

Se introducen ADN monocatenario sintético (ssDNA) químicamente combinado y un grupo de oligionucleótidos en áreas específicas de la célula, creando así modificaciones genéticas. El proceso cíclico implica la transformación de ssDNA (por electroporación) seguido de excrecencia, durante la cual las proteínas de recombinación homólogas de bacteriófagos median la hibridación de ssDNA con sus objetivos genómicos. Los experimentos que se dirigen a marcadores fenotípicos selectivos se criban e identifican colocando las células en medios diferenciales. En última instancia, cada ciclo tarda 2,5 horas en procesarse, y se requiere tiempo adicional para desarrollar cultivos isogénicos y caracterizar mutaciones. Al introducir de forma iterativa bibliotecas de ssDNA mutagénicos dirigidos a múltiples sitios, MAGE puede generar diversidad genética combinatoria en una población celular. Puede haber hasta 50 ediciones del genoma, desde pares de bases de un solo nucleótido hasta el genoma completo o redes de genes simultáneamente con resultados en cuestión de días. ^[39]

Los experimentos MAGE se pueden dividir en tres clases, caracterizadas por diversos grados de escala y complejidad: (i) muchos sitios diana, mutaciones genéticas únicas; (ii) sitio objetivo único, muchas mutaciones genéticas; y (iii) muchos sitios diana, muchas mutaciones genéticas. ^[39] Un ejemplo de la clase tres se reflejó en 2009, donde Church y sus colegas pudieron programar Escherichia colipara producir cinco veces la cantidad normal de licopeno, un antioxidante que normalmente se encuentra en las semillas de tomate y está relacionado con propiedades anticancerígenas. Aplicaron MAGE para optimizar la vía metabólica de 1-desoxi-d-xilulosa-5-fosfato (DXP) en Escherichia coli para producir una sobreproducción de licopeno isoprenoide. Les tomó alrededor de 3 días y poco más de $ 1,000 en materiales. La facilidad, la velocidad y la rentabilidad con la que MAGE puede alterar los genomas puede transformar la forma en que las industrias abordan la fabricación y producción de compuestos importantes en las industrias de bioingeniería, bioenergía, ingeniería biomédica, biología sintética, farmacéutica, agrícola y química.

Aplicaciones

Plantas, animales y genes humanos que se dirigen con éxito utilizando ZFN, lo que demuestra la generalidad de este enfoque.

A partir de 2012, la edición eficiente del genoma se había desarrollado para una amplia gama de sistemas experimentales que van desde plantas hasta animales, a menudo más allá del interés clínico, y se estaba convirtiendo en una estrategia experimental estándar en los laboratorios de investigación. ^[40] La reciente generación de mutantes mediados por ZFN de rata, pez cebra , maíz y tabaco y las mejoras en los enfoques basados ​​en TALEN dan testimonio de la importancia de los métodos, y la lista se está expandiendo rápidamente. La edición del genoma con nucleasas modificadas probablemente contribuirá a muchos campos de las ciencias de la vida, desde el estudio de las funciones de los genes en plantas y animales hasta la terapia génica en humanos. Por ejemplo, el campo de la biología sintéticaque tiene como objetivo diseñar células y organismos para que realicen funciones novedosas, es probable que se beneficie de la capacidad de la nucleasa modificada para agregar o eliminar elementos genómicos y, por lo tanto, crear sistemas complejos. ^[40] Además, las funciones de los genes se pueden estudiar utilizando células madre con nucleasas modificadas genéticamente.

A continuación se enumeran algunas tareas específicas que este método puede realizar:

• Mutación genética dirigida
• Terapia de genes
• Creando reordenamiento cromosómico
• Estudiar la función genética con células madre
• Animales transgénicos
• Etiquetado de genes endógenos
• Adición de transgén dirigida

Modificación genética dirigida en animales

La combinación de descubrimientos recientes en ingeniería genética, particularmente la edición de genes y la última mejora en tecnologías de reproducción bovina (por ejemplo, cultivo de embriones in vitro ) permite la edición del genoma directamente en ovocitos fertilizados utilizando endonucleasas sintéticas altamente específicas. Endonucleasas guiadas por ARN: las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas asociadas a Cas9 (CRISPR / Cas9) son una nueva herramienta, lo que aumenta aún más la gama de métodos disponibles . En particular, las endonucleasas modificadas por ingeniería CRISPR / Cas9 permiten el uso de múltiples ARN guía para Knockouts (KO) simultáneos en un paso mediante inyección citoplásmica directa (CDI) en cigotos de mamíferos. ^[41]

Gracias al desarrollo paralelo de la transcriptómica unicelular, la edición del genoma y los nuevos modelos de células madre, ahora estamos entrando en un período científicamente emocionante en el que la genética funcional ya no se limita a modelos animales, sino que se puede realizar directamente en muestras humanas. El análisis de expresión génica unicelular ha resuelto un mapa de ruta transcripcional del desarrollo humano a partir del cual se están identificando genes candidatos clave para estudios funcionales. Utilizando datos de transcriptómica global para guiar la experimentación, la herramienta de edición del genoma basada en CRISPR ha hecho posible interrumpir o eliminar genes clave para dilucidar la función en un entorno humano. ^[42]

Modificación genética dirigida en plantas

Descripción general del flujo de trabajo y las posibilidades de edición de GEEN

La edición del genoma con meganucleasa , ^[43] ZFN y TALEN proporciona una nueva estrategia para la manipulación genética en plantas y es probable que ayude en la ingeniería de los rasgos deseados de la planta mediante la modificación de genes endógenos. Por ejemplo, la adición de genes específicos del sitio en las principales especies de cultivos se puede utilizar para el "apilamiento de rasgos" mediante el cual varios rasgos deseados se vinculan físicamente para garantizar su co-segregación durante los procesos de reproducción. ^[28] Recientemente se ha informado de avances en tales casos en Arabidopsis thaliana ^{[44] [45] [46]} y Zea mays . En Arabidopsis thaliana, utilizando direccionamiento génico asistido por ZFN, se introdujeron dos genes resistentes a herbicidas (acetolactato sintasa de tabaco SuRA y SuRB) en loci SuR con hasta un 2% de células transformadas con mutaciones. ^[44] En Zea mays, la alteración del locus objetivo se logró mediante los DSB inducidos por ZFN y el NHEJ resultante. ZFN también se utilizó para impulsar el casete de expresión génica de tolerancia a herbicidas (PAT) en el locus endógeno IPK1 objetivo en este caso. ^[47] Se ha demostrado que dicha modificación del genoma observada en las plantas regeneradas es heredable y se transmitió a la siguiente generación. ^[47] Un ejemplo potencialmente exitoso de la aplicación de técnicas de edición del genoma en la mejora de cultivos se puede encontrar en el banano, donde los científicos utilizaronEdición CRISPR / Cas9 para inactivar el virus endógeno del rayado del banano en el genoma B del banano ( Musa spp. ) Para superar un desafío importante en el mejoramiento del banano. ^[48]

Además, la ingeniería del genoma basada en TALEN ha sido ampliamente probada y optimizada para su uso en plantas. ^[49] Las fusiones de TALEN también han sido utilizadas por una empresa estadounidense de ingredientes alimentarios, Calyxt, ^[50] para mejorar la calidad de los productos de aceite de soja ^[51] y aumentar el potencial de almacenamiento de las patatas ^[52]

Es necesario realizar varias optimizaciones para mejorar la edición de genomas de plantas utilizando la focalización mediada por ZFN. ^[53] Existe la necesidad de un diseño confiable y una prueba posterior de las nucleasas, la ausencia de toxicidad de las nucleasas, la elección adecuada del tejido vegetal para el direccionamiento, las rutas de inducción de la actividad enzimática, la falta de mutagénesis fuera del objetivo y una detección confiable de casos mutados. ^[53]

Un método de administración común para CRISPR / Cas9 en plantas es la transformación basada en Agrobacterium . ^[54] El ADN-T se introduce directamente en el genoma de la planta mediante un mecanismo T4SS. Los casetes de expresión basados ​​en Cas9 y gRNA se convierten en plásmidos Ti , que se transforman en Agrobacterium para su aplicación en plantas. ^[54] Para mejorar la entrega de Cas9 en plantas vivas, se están utilizando virus para una entrega transgénica más eficaz. ^[54]

Parte de una serie de artículos sobre
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Investigación

Terapia genética

La práctica ideal de la terapia génica es aquella que reemplaza el gen defectuoso con un alelo normal en su ubicación natural. Esto es ventajoso sobre un gen liberado por virus, ya que no es necesario incluir las secuencias codificantes completas y las secuencias reguladoras cuando solo es necesario alterar una pequeña proporción del gen, como suele ser el caso. ^[55] La expresión de los genes parcialmente reemplazados también es más consistente con la biología celular normal que los genes completos que son transportados por vectores virales.

El primer uso clínico de la edición del genoma basada en TALEN fue en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda CD19 + en un niño de 11 meses en 2015. Se diseñaron células T de donantes modificadas para atacar las células leucémicas, ser resistentes a alemtuzumab y evadir detección por el sistema inmunológico del huésped después de la introducción. ^{[56] [57]}

Se ha realizado una amplia investigación en células y animales utilizando CRISPR-Cas9 para intentar corregir mutaciones genéticas que causan enfermedades genéticas como el síndrome de Down, la espina bífida, la anencefalia y los síndromes de Turner y Klinefelter. ^[58]

En febrero de 2019, los científicos médicos que trabajan con Sangamo Therapeutics , con sede en Richmond, California , anunciaron la primera terapia de edición de genes humanos "en el cuerpo" para alterar permanentemente el ADN en un paciente con síndrome de Hunter . ^[59] Los ensayos clínicos de Sangamo que involucran la edición de genes usando Zinc Finger Nuclease (ZFN) están en curso. ^[60]

Erradicar enfermedades

Los investigadores han utilizado impulsores genéticos CRISPR-Cas9 para modificar genes asociados con la esterilidad en A. gambiae , el vector de la malaria. ^[61] Esta técnica tiene más implicaciones en la erradicación de otras enfermedades transmitidas por vectores, como la fiebre amarilla, el dengue y el Zika. ^[62]

El sistema CRISPR-Cas9 se puede programar para modular la población de cualquier especie bacteriana dirigiéndose a genotipos clínicos o aislados epidemiológicos. Puede habilitar selectivamente las especies bacterianas beneficiosas sobre las dañinas al eliminar el patógeno, lo que le da una ventaja sobre los antibióticos de amplio espectro. ^[39]

Se están investigando aplicaciones antivirales para terapias dirigidas a virus humanos como el VIH, el herpes y el virus de la hepatitis B. CRISPR se puede utilizar para apuntar al virus o al huésped para alterar los genes que codifican las proteínas receptoras de la superficie celular del virus. ^[37] En noviembre de 2018, He Jiankui anunció que había editado dos embriones humanos para intentar desactivar el gen CCR5 , que codifica un receptor que el VIH usa para ingresar a las células. Dijo que las gemelas, Lulu y Nana , habían nacido unas semanas antes. Dijo que las niñas todavía llevaban copias funcionales de CCR5 junto con CCR5 discapacitado ( mosaicismo) y todavía eran vulnerables al VIH. El trabajo fue ampliamente condenado como poco ético, peligroso y prematuro. ^[63]

En enero de 2019, científicos de China informaron sobre la creación de cinco monos idénticos clonados genéticamente editados, utilizando la misma técnica de clonación que se utilizó con Zhong Zhong y Hua Hua , los primeros monos clonados de la historia, y la oveja Dolly , y el mismo gen. Edición de Crispr : técnica Cas9 supuestamente utilizada por He Jiankui para crear los primeros bebés humanos modificados genéticamente, Lulu y Nana . Los clones de mono se hicieron para estudiar varias enfermedades médicas. ^{[64] [65]}

En un futuro próximo, el nuevo sistema CRISPR también podrá erradicar enfermedades y afecciones a las que están predispuestos los seres humanos. Con esta nueva tecnología, los científicos podrán tomar los genes de un espermatozoide y un óvulo humanos y reemplazar los genes que activan el cáncer u otros defectos anormales o no deseados. Esto aliviará el estrés de los padres que se preocupan por tener un hijo y no pueden llevar una vida normal. Después de solo una generación de este proceso, todo el futuro de la raza humana nunca tendría que preocuparse por los problemas de deformidades o condiciones predispuestas. ^[66]

Perspectivas y limitaciones

En el futuro, un objetivo importante de la investigación sobre la edición del genoma con nucleasas modificadas debe ser la mejora de la seguridad y la especificidad de la acción de las nucleasas. ^[67] Por ejemplo, mejorar la capacidad de detectar eventos fuera del objetivo puede mejorar nuestra capacidad para aprender sobre las formas de prevenirlos. Además, los dedos de zinc utilizados en los ZFN rara vez son completamente específicos y algunos pueden causar una reacción tóxica. Sin embargo, se ha informado que la toxicidad se reduce mediante modificaciones realizadas en el dominio de escisión del ZFN. ^[55]

Además, la investigación de Dana Carroll sobre la modificación del genoma con nucleasas modificadas ha demostrado la necesidad de comprender mejor la maquinaria básica de recombinación y reparación del ADN. En el futuro, un posible método para identificar objetivos secundarios sería capturar los extremos rotos de las células que expresan los ZFN y secuenciar el ADN flanqueante mediante una secuenciación de alto rendimiento. ^[55]

Debido a la facilidad de uso y la rentabilidad de CRISPR, actualmente se está realizando una investigación exhaustiva al respecto. Ahora hay más publicaciones sobre CRISPR que ZFN y TALEN a pesar de lo reciente que es el descubrimiento de CRISPR. ^[37] Tanto CRISPR como TALEN se ven favorecidos por ser las opciones a implementar en producciones a gran escala debido a su precisión y eficiencia.

La edición del genoma ocurre también como un proceso natural sin ingeniería genética artificial. Los agentes que son competentes para editar códigos genéticos son virus o agentes de ARN subvíricos.

Aunque GEEN tiene una eficiencia más alta que muchos otros métodos en genética inversa, todavía no es muy eficiente; en muchos casos, menos de la mitad de las poblaciones tratadas obtienen los cambios deseados. ^[44] Por ejemplo, cuando uno planea usar el NHEJ de la célula para crear una mutación, los sistemas HDR de la célula también estarán trabajando corrigiendo el DSB con tasas mutacionales más bajas.

Tradicionalmente, los ratones han sido la opción más común para los investigadores como anfitrión de un modelo de enfermedad. CRISPR puede ayudar a cerrar la brecha entre este modelo y los ensayos clínicos en humanos mediante la creación de modelos de enfermedades transgénicas en animales más grandes como cerdos, perros y primates no humanos. ^{[68] [69]} Usando el sistema CRISPR-Cas9, la proteína Cas9 programada y el sgRNA pueden introducirse directamente en cigotos fertilizados para lograr las modificaciones genéticas deseadas al crear modelos transgénicos en roedores. Esto permite pasar por alto la etapa habitual de selección de células en la generación de líneas transgénicas y, como resultado, reduce el tiempo de generación en un 90%. ^[69]

Un potencial que aporta CRISPR con su eficacia es la aplicación de xenotrasplantes. En ensayos de investigación anteriores, CRISPR demostró la capacidad de apuntar y eliminar retrovirus endógenos, lo que reduce el riesgo de transmisión de enfermedades y reduce las barreras inmunes. ^{[37] La} eliminación de estos problemas mejora la función de los órganos del donante, lo que acerca esta aplicación a la realidad.

En las plantas, la edición del genoma se considera una solución viable para la conservación de la biodiversidad. El impulso genético es una herramienta potencial para alterar la tasa de reproducción de las especies invasoras , aunque existen importantes riesgos asociados. ^[70]

Mejora humana

Muchos transhumanistas ven la edición del genoma como una herramienta potencial para la mejora humana . ^{[71] [72] [73]} El biólogo australiano y profesor de genética David Andrew Sinclair señala que "las nuevas tecnologías con edición del genoma permitirán que se utilice en individuos (...) para tener (...) hijos más sanos" - bebés de diseño . ^[74] Según un informe de septiembre de 2016 del Consejo de Bioética de Nuffield, en el futuro puede ser posible mejorar a las personas con genes de otros organismos o genes totalmente sintéticos para, por ejemplo, mejorar la visión nocturna y el sentido del olfato . ^{[75] [76]}

La Academia Nacional Estadounidense de Ciencias y la Academia Nacional de Medicina emitieron un informe en febrero de 2017 que brinda apoyo calificado a la edición del genoma humano. ^[77] Recomendaron que los ensayos clínicos para la edición del genoma podrían permitirse algún día una vez que se hayan encontrado respuestas a los problemas de seguridad y eficiencia "pero solo para condiciones graves bajo una supervisión estricta". ^[78]

Riesgos

En la declaración de la Evaluación mundial de amenazas de la comunidad de inteligencia de EE. UU. De 2016, el director de Inteligencia Nacional de los Estados Unidos, James R. Clapper , nombró la edición del genoma como un arma potencial de destrucción masiva , afirmando que la edición del genoma realizada por países con estándares regulatorios o éticos "diferentes de Los países occidentales "probablemente aumentan el riesgo de creación de agentes o productos biológicos nocivos". Según el comunicado, la amplia distribución, el bajo costo y el ritmo acelerado de desarrollo de esta tecnología, su uso indebido deliberado o involuntario podrían tener consecuencias económicas y de seguridad nacional de gran alcance. ^{[79] [80] [81]}Por ejemplo, tecnologías como CRISPR podrían usarse para producir "mosquitos asesinos" que causan plagas que acaban con los cultivos básicos. ^[81]

Según un informe de septiembre de 2016 del Nuffield Council on Bioethics , la simplicidad y el bajo costo de las herramientas para editar el código genético permitirán a los aficionados, o " biohackers ", realizar sus propios experimentos, lo que representa un riesgo potencial por la liberación de genéticamente modificados. insectos. La revisión también encontró que los riesgos y beneficios de modificar el genoma de una persona, y hacer que esos cambios se transmitan a las generaciones futuras, son tan complejos que exigen un escrutinio ético urgente. Tales modificaciones podrían tener consecuencias no deseadas que podrían dañar no solo al niño, sino también a sus futuros hijos, ya que el gen alterado estaría en su esperma o en sus óvulos. ^{[75] [76]} En 2001, los investigadores australianos Ronald Jackson e Ian Ramshaw fueron criticados por publicar un artículo en el Journal of Virology que exploraba el control potencial de los ratones, una plaga importante en Australia, al infectarlos con un virus de la viruela del ratón alterado que causaría infertilidad debido a la sensibilidad proporcionada. La información podría llevar a la fabricación de armas biológicas por bioterroristas potenciales que podrían utilizar el conocimiento para crear cepas resistentes a las vacunas de otros virus de la viruela, como la viruela , que podrían afectar a los seres humanos. ^{[76] [82]} Además, existen preocupaciones adicionales sobre los riesgos ecológicos de la liberación de genes impulsores en poblaciones silvestres. ^{[76][83] [84]}

Ver también

• CRISPR / Cpf1
• Edición de epigenoma
• Tecnología de elección germinal
• NgAgo , una endonucleasa argonauta guiada por ssDNA

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Lectura adicional

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• "Genes humanos personalizados: nuevas promesas y peligros" . Scientific American . Consultado el 21 de febrero de 2019 .
• Connor S (25 de abril de 2014). "División científica - el avance del genoma humano dividiendo a antiguos colegas" . The Independent . Consultado el 11 de febrero de 2016 .
• "¿Qué es la edición del genoma?" . yourgenome.org . Consultado el 13 de abril de 2018 .