Microscopía con excitación de superficie UV
La microscopía con excitación de superficie UV ( MUSE ) es un nuevo método de microscopía que utiliza la penetración superficial de la excitación de fotones UV (230–300 nm ). [1] [2] [3] [4] En comparación con los microscopios convencionales, que generalmente requieren cortes para excluir las señales borrosas desde fuera del plano focal, la baja profundidad de penetración de MUSE limita el volumen de excitación a una capa delgada y elimina el corte de tejido. requisito. Toda la señal recolectada es la luz deseada, y todos los fotones recolectados contribuyen a la formación de la imagen.
La configuración del microscopio se basa en un diseño de microscopio invertido. [2] [3] [4] Se utiliza una platina automatizada para grabar áreas más grandes mediante la creación de mosaicos de una serie de fotogramas adyacentes individuales. La luz del LED se enfoca utilizando una lente esférica con una distancia focal corta sobre la superficie de la muestra en un esquema de iluminación cis de ángulo oblicuo , ya que la óptica de microscopía estándar no transmite la luz ultravioleta de manera eficiente. No se requiere un espejo o filtro dicroico ya que los objetivos del microscopio son opacos a la luz de excitación UV. La luz de fluorescencia emitida se recolectó utilizando un objetivo de larga distancia de trabajo y se enfocó a través de una lente de tubo en una cámara CCD ..
Las muestras se sumergen en colorante exógeno durante 10 segundos y luego se lavan brevemente en agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS). [2] Los especímenes teñidos resultantes generaron señales lo suficientemente brillantes para una visualización directa e interpretable a través del ocular del microscopio.
El trabajo anterior de MUSE incluye la detección de moléculas fluorescentes endógenas en tejidos clínicos y humanos intactos para la caracterización funcional y estructural, que está limitada por la autofluorescencia relativamente tenue que se encuentra en el tejido. Sin embargo, el uso de tintes exógenos brillantes puede proporcionar una luz remitida sustancialmente mayor que el enfoque de autofluorescencia .
Se han estudiado varios tintes para la aplicación de MUSE, incluidos eosina , rodamina , DAPI , Hoechst , naranja de acridina , yodo de propidio y proflavina . [2] La eosina y la rodamina tiñen el citoplasma y la matriz extracelular, haciendo visible la mayor parte del tejido. Hoechst y DAPI emiten una fluorescencia brillante cuando se unen al ADN , lo que les permite servir como excelentes tinciones nucleares.
Los diagnósticos basados en microscopio se realizan ampliamente y sirven como estándar de oro en el análisis histológico. Sin embargo, este procedimiento generalmente requiere una serie de procedimientos de laboratorio que consumen mucho tiempo, incluidos la fijación, la incrustación en parafina, el corte y la tinción para producir portaobjetos de microscopio con portaobjetos de tejido ópticamente delgados (4-6 µm). Si bien en las regiones desarrolladas se usa comúnmente la histología, las personas que viven en áreas con recursos limitados difícilmente pueden acceder a ella y, en consecuencia, necesitan una forma más eficiente y de bajo costo para acceder al diagnóstico patológico. [5] [6]La principal importancia del sistema MUSE proviene de su capacidad para producir imágenes microscópicas de alta resolución con características subcelulares de manera eficiente en el tiempo con menos costos y menos requisitos de experiencia de laboratorio. Con una excitación ultravioleta profunda de 280 nm y un diseño de hardware simple pero robusto, el sistema MUSE puede recopilar señales de fluorescencia sin necesidad de técnicas de filtrado de fluorescencia o reconstrucción matemática compleja de imágenes. [1] Tiene potencial para generar imágenes de alta calidad que contienen más información que los portaobjetos de microscopio en términos de sus características de 2,5 dimensiones. Las imágenes MUSE se han validado con valores de diagnóstico. [2] [3] El sistema es capaz de producir imágenes de varios tipos de tejidos en diferentes tamaños, frescos o fijos.
