Las tinciones de Hoechst son parte de una familia de tintes fluorescentes azules que se utilizan para teñir el ADN . [1] [2] Estas Bis-benzimidas fueron desarrolladas originalmente por Hoechst AG , que enumeró todos sus compuestos de modo que el tinte Hoechst 33342 es el compuesto 33,342º fabricado por la compañía. Hay tres tinciones de Hoechst relacionadas: Hoechst 33258, Hoechst 33342 y Hoechst 34580. Los tintes Hoechst 33258 y Hoechst 33342 son los más utilizados y tienen espectros de excitación - emisión similares .
Caracteristicas moleculares
Ambos tintes son excitados por luz ultravioleta a alrededor de 350 nm y ambos emiten luz fluorescente azul-cian alrededor de un espectro de emisión máximo a 461 nm. El tinte no unido tiene su máxima emisión de fluorescencia en el rango de 510–540 nm. Las manchas de Hoechst se pueden excitar con una lámpara de arco de xenón o mercurio o con un láser ultravioleta . Existe un considerable cambio de Stokes entre los espectros de excitación y emisión que hace que los tintes Hoechst sean útiles en experimentos en los que se utilizan múltiples fluoróforos . La intensidad de fluorescencia de los tintes Hoechst también aumenta con el pH del disolvente . [3]
Los tintes Hoechst son solubles en agua y en disolventes orgánicos como dimetilformamida o dimetilsulfóxido . Se pueden alcanzar concentraciones de hasta 10 mg / ml. Las soluciones acuosas son estables a 2-6 ° C durante al menos seis meses cuando se protegen de la luz. Para el almacenamiento a largo plazo, las soluciones se congelan a -20 ° C o menos. [3]
Los colorantes se unen al surco menor del ADN bicatenario con preferencia por secuencias ricas en adenina y timina . Aunque los colorantes se pueden unir a todos los ácidos nucleicos, las hebras de ADN de doble hebra ricas en AT mejoran la fluorescencia considerablemente. [4] Los tintes Hoechst son permeables a las células y pueden unirse al ADN en células vivas o fijas . Por lo tanto, estas tinciones a menudo se denominan supravitales , lo que significa que las células vivas sobreviven a un tratamiento con estos compuestos. Las células que expresan proteínas transportadoras de casete de unión a ATP específicas también pueden transportar activamente estas tinciones fuera de su citoplasma . [ cita requerida ]
Aplicaciones
Se suele utilizar una concentración de 0,1 a 12 μg / ml para teñir el ADN en bacterias o células eucariotas . Las células se tiñen durante 1-30 min a temperatura ambiente o 37 ° C y luego se lavan para eliminar el tinte no unido. Se puede observar una fluorescencia verde de tinte Hoechst no unido en muestras que se tiñen con demasiado tinte o que se lavan parcialmente. [3] Los tintes Hoechst se utilizan a menudo como sustitutos de otro tinte de ácido nucleico llamado DAPI .
Las diferencias clave entre los tintes Hoechst y DAPI son:
- Los tintes Hoechst son menos tóxicos que DAPI, lo que asegura una mayor viabilidad de las células teñidas [5]
- El grupo etilo adicional de los tintes Hoechst los hace más permeables a las células. [ cita requerida ]
- Hay tintes de tinción de núcleos que permiten la viabilidad de las células después de la tinción. [ cita requerida ]
Hoechst 33342 y 33258 se apagan con bromodesoxiuridina (BrdU), que se usa comúnmente para detectar células en división. Hoechst 33342 exhibe una permeabilidad celular 10 veces mayor que la H 33258. Las células pueden integrar BrdU en ADN recién sintetizado como sustituto de la timidina . Cuando BrdU se integra en el ADN, se supone que el bromo deforma el surco menor de modo que los tintes Hoechst no pueden alcanzar su sitio de unión óptimo. La unión de los tintes Hoechst es incluso más fuerte al ADN sustituido con BrdU; sin embargo, no se produce fluorescencia. Los tintes Hoechst se pueden usar con BrdU para monitorear la progresión del ciclo celular . [6] [7]
Los tintes Hoechst se utilizan comúnmente para teñir el ADN genómico en las siguientes aplicaciones:
- Microscopía de fluorescencia e inmunohistoquímica , a menudo con otros fluoróforos [8]
- Citometría de flujo para contar o clasificar células. Un ejemplo es el uso de tintes Hoechst para analizar cuántas células de una población se encuentran en qué fase del ciclo celular [9]
- Detección de ADN en presencia de ARN en geles de agarosa [10]
- Determinación automatizada de ADN [11]
- Clasificación de cromosomas [10]
La salida de Hoechst también se utiliza para estudiar células madre hematopoyéticas y embrionarias. Como estas células pueden expulsar eficazmente el tinte, pueden detectarse mediante citometría de flujo en lo que se denomina población secundaria . Esto se hace pasando la fluorescencia emitida por el hoechst excitado a través de los filtros rojo y azul, y trazando el hoechst rojo y azul entre sí. [ cita requerida ]
Toxicidad y seguridad
Debido a que las tinciones de Hoechst se unen al ADN, interfieren con la replicación del ADN durante la división celular . En consecuencia, son potencialmente mutagénicos y cancerígenos , por lo que se debe tener cuidado en su manipulación y eliminación. La tinción de Hoechst se utiliza para clasificar los espermatozoides en ganado y seres humanos. Se ha debatido su seguridad. [12] [13]
Ver también
- Bisbenzimida
- Carcinógeno
- DAPI
- Proteína de unión al ADN
- Estado emocionado
- Fluorescencia
- Microscopio fluorescente
- Fluoróforo
- Citometría de flujo
- Hoechst AG
- Inmunohistoquímica
- Lexitropsina
- Surco menor
- Mutageno
- Netropsina
- Comparación de software de simulación de ácidos nucleicos
- Pentamidina
- Apagado (fluorescencia)
- Cambio de Stokes
Referencias
- ^ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD (julio de 1975). "Desarrollos recientes en la detección de síntesis de ácido desoxirribonucleico por fluorescencia 33258 Hoechst" . Revista de histoquímica y citoquímica . 23 (7): 493–505. doi : 10.1177 / 23.7.1095650 . PMID 1095650 .
- ^ Latt, SA; Stetten, G (enero de 1976). "Estudios espectrales sobre 33258 Hoechst y tintes de bisbenzimidazol relacionados útiles para la detección fluorescente de la síntesis de ácido desoxirribonucleico" . Revista de histoquímica y citoquímica . 24 (1): 24–33. doi : 10.1177 / 24.1.943439 . PMID 943439 .
- ^ a b c "Manchas de Hoechst" (PDF) . Invitrogren (sondas moleculares). Archivado desde el original (PDF) el 19 de abril de 2009.
- ^ Portugal, J; Waring, MJ (28 de febrero de 1988). "Asignación de sitios de unión de ADN para 4 ′, 6-diamidina-2-fenilindol y bisbencimida (Hoechst 33258). Un estudio comparativo de huella". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Estructura y expresión génica . 949 (2): 158–68. doi : 10.1016 / 0167-4781 (88) 90079-6 . PMID 2449244 .
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enlaces externos
- Rastros espectrales para tintes fluorescentes
- Manual para tinciones Hoechst
- Una guía en línea de sondas fluorescentes y tecnologías de etiquetado comercial