La purificación por gradiente de solvente en contracorriente multicolumna (MCSGP) es una forma de cromatografía que se utiliza para separar o purificar biomoléculas de mezclas complejas. Fue desarrollado en el Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zúrich por Aumann y Morbidelli. [1] El proceso consta de dos a seis columnas cromatográficas que están conectadas entre sí de tal manera que a medida que la mezcla se mueve a través de las columnas, el compuesto se purifica en varias fracciones.
Descripción general
El proceso MCSGP consta de varias, al menos dos, columnas cromatográficas que se cambian en posición opuesta a la dirección del flujo (ver animación del proceso ). La mayoría de las columnas están equipadas con una bomba de gradiente para ajustar la concentración del modificador en la entrada de la columna. Algunas columnas están conectadas directamente, de modo que los flujos de productos no puros se reciclan internamente. Otras columnas están en cortocircuito, de modo que operan en modo por lotes puro. El sistema se divide en varias secciones, desde las cuales cada sección realiza una tarea análoga a las tareas de una purificación por lotes. Estas tareas son: cargar la alimentación, ejecutar la elución del gradiente, reciclar las fracciones del sitio de adsorción débil, fraccionar el producto purificado, reciclar las fracciones del sitio de adsorción fuerte, limpiar la columna de impurezas que adsorben fuertemente, limpiar en el lugar y reequilibrar la columna. para iniciar la siguiente corrida de purificación. Todas las tareas mencionadas aquí se llevan a cabo al mismo tiempo en una unidad. El reciclaje de las fracciones laterales no puras se realiza en movimiento en contracorriente.
Comparación con otros métodos de purificación
Las biomoléculas se purifican a menudo mediante cromatografía discontinua en gradiente de disolvente . Aquí se aplican gradientes de solvente lineales suaves para manejar cuidadosamente la separación entre el componente deseado y cientos de impurezas. El producto deseado suele ser intermedio entre las impurezas de absorción débil y fuerte. Se requiere un corte central para obtener el producto puro deseado. A menudo, las resinas preparativas tienen una baja eficacia debido a la fuerte dispersión axial y la lenta transferencia de masa . Entonces no es posible una purificación en un paso cromatográfico. Se requeriría el movimiento a contracorriente como se conoce del proceso SMB . Para producciones a gran escala y para moléculas muy valiosas, es necesario aplicar un movimiento de sólidos en contracorriente para aumentar la eficiencia de separación, el rendimiento y la productividad de la purificación. El proceso MCSGP combina ambas técnicas en un solo proceso, el principio SMB a contracorriente y la técnica por lotes de gradiente de solvente.
El modo discontinuo consta de etapas de equilibrado, carga, lavado, purificación y regeneración. El modo de funcionamiento discontinuo permite aprovechar la ventaja de los gradientes de solvente, pero implica altos consumos de solvente y bajas productividades con respecto a los procesos continuos en contracorriente. Un proceso establecido de este tipo es la técnica de lecho móvil simulado (SMB) que requiere los pasos de equilibrado, lavado y regeneración que consumen solventes solo una vez por operación y tiene una mejor utilización de la resina. Sin embargo, los principales inconvenientes de SMB son la incapacidad de separar una mezcla en tres fracciones y la falta de aplicabilidad en gradiente de disolvente. En el caso de los anticuerpos, la técnica más avanzada se basa en la cromatografía de afinidad discontinua (con Proteína A o Proteína G como ligandos) que es capaz de unir selectivamente moléculas de anticuerpo. En general, las técnicas de afinidad tienen la ventaja de purificar biomoléculas con altos rendimientos y purezas, pero las desventajas son, en general, el elevado coste de la fase estacionaria, la lixiviación del ligando y la capacidad de limpieza reducida.
El proceso MCSGP puede resultar en purezas y rendimientos comparables a los de la purificación usando Proteína A . El segundo ejemplo de aplicación para el prototipo MCSGP es la separación de tres variantes de MAb utilizando una resina de intercambio catiónico débil preparativa. Aunque la variante de MAb de elución intermedia solo se puede obtener con un 80% de pureza con recuperaciones cercanas a cero en un proceso cromatográfico discontinuo, el proceso MCSGP puede proporcionar un 90% de pureza con un rendimiento del 93%. Se ha realizado una comparación numérica del proceso MCSGP con el proceso cromatográfico por lotes, y un proceso cromatográfico por lotes que incluye el reciclaje ideal, utilizando una purificación de polipéptidos industrial como sistema modelo. Muestra que el proceso MCSGP puede aumentar la productividad en un factor de 10 y reducir el requerimiento de solvente en un 90%. [2]
Las principales ventajas con respecto a la cromatografía discontinua en gradiente de solvente son altos rendimientos también para separaciones difíciles, menor consumo de solvente, mayor productividad, uso de movimiento de sólidos en contracorriente, lo que aumenta la eficiencia de separación. El proceso es continuo. Una vez que se alcanza un estado estable, entrega un producto purificado continuamente en calidad y cantidad constantes. La limpieza automática in situ está integrada. Es posible un diseño empírico puro de las condiciones de funcionamiento a partir de un cromatograma discontinuo de gradiente de disolvente único.
Aplicaciones
Todas las purificaciones y separaciones cromatográficas que se ejecutan mediante cromatografía discontinua en gradiente de disolvente se pueden realizar utilizando MCSGP. Son ejemplos típicos la purificación de péptidos en fase inversa , la cromatografía de interacción hidrófoba para ácidos grasos o, por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico de proteínas o anticuerpos . El proceso puede enriquecer eficazmente los componentes, que se han alimentado solo en pequeñas cantidades. La captura continua de anticuerpos sin cromatografía de afinidad se puede realizar con el proceso MCSGP. [3]
Referencias
- ^ Subramanian, Ganapathy (2007), Bioseparación y bioprocesamiento , Wiley-VCH, p. 235, ISBN 978-3-527-31585-7
- ^ Guido Ströhlein; Lars Aumann; Thomas Müller-Späth; Abhijit Tarafder; Massimo Morbidelli (2 de febrero de 2007), "El proceso de purificación de gradiente de solvente en contracorriente multicolumna: un proceso cromatográfico continuo para anticuerpos monoclonales sin usar proteína a" , Biopharm International , archivado desde el original el 7 de julio de 2012 , consultado el 22 de mayo de 2009
- ^ Lars Aumann; Massimo Morbidelli (2007), "Un proceso continuo de purificación en gradiente de solvente en contracorriente en múltiples columnas (MCSGP)" , Biotecnología y Bioingeniería , 98 (5): 1043-1055, doi : 10.1002 / bit.21527 , PMID 17570708 , S2CID 30860915 , archivado de la original el 2013-01-05