La secuenciación de nanoporos es un enfoque de tercera generación [1] utilizado en la secuenciación de biopolímeros , específicamente, polinucleótidos en forma de ADN o ARN .
Utilizando la secuenciación de nanoporos, se puede secuenciar una sola molécula de ADN o ARN sin necesidad de amplificación por PCR o etiquetado químico de la muestra. Al menos uno de estos pasos antes mencionados es necesario en el procedimiento de cualquier enfoque de secuenciación desarrollado previamente. La secuenciación de nanoporos tiene el potencial de ofrecer genotipado de costo relativamente bajo , alta movilidad para las pruebas y procesamiento rápido de muestras con la capacidad de mostrar resultados en tiempo real. Las publicaciones sobre el método describen su uso en la identificación rápida de patógenos virales, [2] monitoreo del ébola , [3] monitoreo ambiental, [4] monitoreo de seguridad alimentaria, secuenciación del genoma humano, [5] secuenciación del genoma vegetal, [6] monitoreo de antibióticos resistencia , [7] haplotipado [8] y otras aplicaciones.
Desarrollo
La secuenciación de nanoporos tardó 25 años en materializarse por completo. Implicó una estrecha colaboración entre la academia y la industria. Una de las primeras personas que propuso la idea de la secuenciación de nanoporos fue el profesor David Deamer . En 1989, esbozó un plan para conducir una sola hebra de ADN a través de un nanoporo de proteína incrustado en una membrana delgada como parte de su trabajo para sintetizar ARN desde cero. Al darse cuenta de que el mismo enfoque podría tener potencial para mejorar la secuenciación del ADN, Deamer y su equipo pasaron la siguiente década probándolo. En 1999, Deamer y sus colegas publicaron el primer artículo utilizando el término "secuenciación de nanoporos" y dos años más tarde produjeron una imagen que capturaba una horquilla de ADN que pasaba a través de un nanoporo en tiempo real. Otra base para la secuenciación de nanoporos fue establecida por el trabajo de un equipo dirigido por el profesor Hagan Bayley, quien desde la década de 1990 comenzó a desarrollar de forma independiente la detección estocástica, una técnica que mide el cambio en una corriente iónica que pasa a través de un nanoporo para determinar la concentración e identidad de una sustancia. Para 2005, Bayley había logrado un progreso sustancial con el método para secuenciar el ADN y cofundó Oxford Nanopore para ayudar a impulsar la tecnología más allá. Desde el principio, la empresa creyó que la secuenciación de nanoporos proporcionaba un medio para hacer que la secuenciación del ADN fuera mucho más barata y rápida y ya no dependiera de reactivos y equipos costosos, lo que hacía que el proceso fuera el coto de los laboratorios altamente centralizados con sede en países de altos ingresos. En 2014, la compañía lanzó su primer dispositivo portátil de secuenciación de nanoporos. Esto marcó un gran avance, ya que hizo posible que la secuenciación del ADN se llevara a cabo en casi cualquier lugar, incluso en áreas remotas con recursos limitados. Esto ha abierto un nuevo capítulo para detectar, rastrear y trazar la evolución de patógenos emergentes detrás del brote de epidemias en tiempo real sobre el terreno. Ha jugado un papel fundamental, por ejemplo, en la pandemia de COVID-19. Una cuarta parte de todos los genomas del virus SARS-Cov2 del mundo se han secuenciado ahora con dispositivos de nanoporos. La tecnología también ofrece una herramienta importante para combatir la resistencia a los antimicrobianos, una amenaza cada vez mayor para la salud pública. Este es solo el comienzo de las muchas aplicaciones que ahora ofrece la secuenciación de nanoporos. [9]
Principios de detección
La membrana biológica o de estado sólido, donde se encuentra el nanoporo , está rodeada por una solución de electrolitos. [10] La membrana divide la solución en dos cámaras. [11] Se aplica un voltaje de polarización a través de la membrana induciendo un campo eléctrico que impulsa partículas cargadas, en este caso los iones, en movimiento. Este efecto se conoce como electroforesis . Para concentraciones suficientemente altas, la solución de electrolitos está bien distribuida y toda la caída de voltaje se concentra cerca y dentro del nanoporo. Esto significa que las partículas cargadas en la solución solo sienten una fuerza del campo eléctrico cuando están cerca de la región de los poros. [12] Esta región a menudo se conoce como la región de captura. Dentro de la región de captura, los iones tienen un movimiento dirigido que se puede registrar como una corriente iónica estable colocando electrodos cerca de la membrana. Imagine ahora un polímero de tamaño nanométrico, como ADN o proteína, colocado en una de las cámaras. Esta molécula también tiene una carga neta que siente una fuerza del campo eléctrico cuando se encuentra en la región de captura. [12] La molécula se acerca a esta región de captura ayudada por el movimiento browniano y cualquier atracción que pueda tener hacia la superficie de la membrana. [12] Una vez dentro del nanoporo, la molécula se transloca a través de una combinación de fuerzas electroforéticas, electro-osmóticas y, a veces, termoforéticas. [10] Dentro del poro, la molécula ocupa un volumen que restringe parcialmente el flujo de iones, observado como una caída de corriente iónica. Según varios factores, como la geometría, el tamaño y la composición química, variará el cambio de magnitud de la corriente iónica y la duración de la translocación. A continuación, se pueden detectar e identificar potencialmente diferentes moléculas basándose en esta modulación en la corriente iónica. [13]
Identificación de la base
La magnitud de la densidad de la corriente eléctrica a través de la superficie de un nanoporo depende de las dimensiones del nanoporo y de la composición del ADN o ARN que ocupa el nanoporo. La secuenciación fue posible porque, al pasar por el canal del nanoporo, las muestras provocan cambios característicos en la densidad de la corriente eléctrica que fluye a través del nanoporo. La carga total que fluye a través de un canal de nanoporos es igual a la integral de superficie del flujo de densidad de corriente eléctrica a través de las superficies normales de la unidad de nanoporos entre los tiempos t 1 y t 2 .
Tipos
Biológico
La secuenciación biológica de nanoporos se basa en el uso de proteínas transmembrana, llamadas porinas , que están incrustadas en membranas lipídicas para crear superficies porosas dependientes del tamaño, con "agujeros" a escala nanométrica distribuidos a través de las membranas. Se puede lograr una velocidad de translocación suficientemente baja mediante la incorporación de varias proteínas que facilitan el movimiento del ADN o ARN a través de los poros de las membranas lipídicas. [14]
Alfa hemolisina
La alfa hemolisina (αHL), un nanoporo de una bacteria que causa la lisis de los glóbulos rojos, se ha estudiado durante más de 15 años. [15] Hasta este punto, los estudios han demostrado que las cuatro bases pueden identificarse utilizando la corriente iónica medida a través del poro de αHL. [16] [17] La estructura de αHL es ventajosa para identificar bases específicas que se mueven a través del poro. El poro de αHL tiene ~ 10 nm de largo, con dos secciones distintas de 5 nm. La sección superior consta de una estructura similar a un vestíbulo más grande y la sección inferior consta de tres posibles sitios de reconocimiento (R1, R2, R3) y es capaz de discriminar entre cada base. [16] [17]
La secuenciación con αHL se ha desarrollado mediante un estudio básico y mutaciones estructurales, avanzando hacia la secuenciación de lecturas muy largas. La mutación proteica de αHL ha mejorado la capacidad de detección del poro. [18] El siguiente paso propuesto es unir una exonucleasa al poro de αHL. La enzima escindiría periódicamente bases individuales, lo que permitiría al poro identificar bases sucesivas. El acoplamiento de una exonucleasa al poro biológico ralentizaría la translocación del ADN a través del poro y aumentaría la precisión de la adquisición de datos.
En particular, los teóricos han demostrado que la secuenciación mediante enzimas exonucleasas como se describe aquí no es factible. [19] Esto se debe principalmente a los efectos relacionados con la difusión que imponen un límite a la probabilidad de captura de cada nucleótido a medida que se escinde. Esto da como resultado una probabilidad significativa de que un nucleótido no sea capturado antes de que se difunda en la masa o sea capturado fuera de orden y, por lo tanto, no sea secuenciado correctamente por el nanoporo, dando lugar a errores de inserción y deleción. Por lo tanto, se necesitan cambios importantes en este método antes de que pueda considerarse una estrategia viable.
Un estudio reciente ha señalado la capacidad de αHL para detectar nucleótidos en dos sitios separados en la mitad inferior del poro. [20] Los sitios R1 y R2 permiten que cada base sea monitoreada dos veces a medida que se mueve a través del poro, creando 16 valores de corriente iónica medibles diferentes en lugar de 4. Este método mejora la lectura única a través del nanoporo al duplicar los sitios que la secuencia se lee por nanoporo.
MspA
Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) es el segundo nanoporo biológico que se está investigando actualmente para la secuenciación de ADN. El poro de MspA se ha identificado como una mejora potencial con respecto a αHL debido a una estructura más favorable. [21] El poro se describe como una copa con un borde grueso y un diámetro de 1,2 nm en la parte inferior del poro. [22] Una MspA natural, si bien es favorable para la secuenciación del ADN debido a su forma y diámetro, tiene un núcleo negativo que prohibía la translocación del ADN monocatenario (ssDNA). El nanoporo natural se modificó para mejorar la translocación al reemplazar tres ácidos aspártico cargados negativamente con asparaginas neutras. [23]
Se ha demostrado que la detección por corriente eléctrica de nucleótidos a través de la membrana es diez veces más específica que la αHL para identificar bases. [21] Utilizando esta especificidad mejorada, un grupo de la Universidad de Washington propuso usar ADN bicatenario (dsDNA) entre cada molécula monocatenaria para mantener la base en la sección de lectura del poro. [21] [23] El dsDNA detendría la base en la sección correcta del poro y permitiría la identificación del nucleótido. Se ha concedido una subvención reciente a una colaboración de UC Santa Cruz, la Universidad de Washington y la Universidad Northeastern para mejorar el reconocimiento de base de MspA utilizando polimerasa phi29 junto con el poro. [24]
De Estado sólido
Los enfoques de secuenciación de nanoporos de estado sólido, a diferencia de la secuenciación biológica de nanoporos, no incorporan proteínas en sus sistemas. En cambio, la tecnología de nanoporos de estado sólido utiliza varios sustratos de metal o aleación de metal con poros de tamaño nanométrico que permiten el paso del ADN o ARN. Estos sustratos suelen desempeñar funciones integrales en el reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos a medida que se traslocan a través de los canales a lo largo de los sustratos. [25]
Corriente de tunelización
La medición del túnel de electrones a través de las bases a medida que el ssDNA se transloca a través del nanoporo es un método mejorado de secuenciación de nanoporos en estado sólido. La mayor parte de la investigación se ha centrado en probar que las bases podrían determinarse mediante el túnel de electrones. Estos estudios se realizaron utilizando un microscopio de sonda de barrido como electrodo sensor y han demostrado que las bases pueden identificarse mediante corrientes de efecto túnel específicas. [26] Después de la investigación de prueba de principio, se debe crear un sistema funcional para acoplar el poro de estado sólido y los dispositivos de detección.
Los investigadores del grupo Harvard Nanopore han diseñado poros de estado sólido con nanotubos de carbono de pared simple a lo largo del diámetro del poro. [27] Se crean matrices de poros y se utiliza la deposición de vapor químico para crear nanotubos que crecen a través de la matriz. Una vez que un nanotubo ha crecido a través de un poro, el diámetro del poro se ajusta al tamaño deseado. La creación exitosa de un nanotubo acoplado con un poro es un paso importante hacia la identificación de bases a medida que el ssDNA se transloca a través del poro en estado sólido.
Otro método es el uso de nanoelectrodos a cada lado de un poro. [28] [29] Los electrodos se crean específicamente para permitir la formación de un nanoporo de estado sólido entre los dos electrodos. Esta tecnología podría usarse no solo para detectar las bases, sino también para ayudar a controlar la velocidad y la orientación de la translocación de la base.
Fluorescencia
Se ha desarrollado una técnica eficaz para determinar una secuencia de ADN utilizando nanoporos de estado sólido y fluorescencia . [30] Este método de secuenciación de fluorescencia convierte cada base en una representación característica de múltiples nucleótidos que se unen a una sonda fluorescente que forma una cadena de ADNds. Con el sistema de dos colores propuesto, cada base se identifica mediante dos fluorescencias independientes y, por tanto, se convertirá en dos secuencias específicas. Las sondas constan de un fluoróforo y un extintor al principio y al final de cada secuencia, respectivamente. Cada fluoróforo será extinguido por el extintor al final de la secuencia anterior. Cuando el dsDNA se transloca a través de un nanoporo de estado sólido, la hebra de la sonda se eliminará y el fluoróforo corriente arriba emitirá fluorescencia. [30] [31]
Este método de secuenciación tiene una capacidad de 50-250 bases por segundo por poro, y un sistema de fluoróforo de cuatro colores (cada base podría convertirse en una secuencia en lugar de dos), secuenciará más de 500 bases por segundo. [30] Las ventajas de este método se basan en la lectura de secuenciación clara, utilizando una cámara en lugar de métodos de corriente ruidosos. Sin embargo, el método requiere preparación de muestras para convertir cada base en un código binario expandido antes de la secuenciación. En lugar de identificar una base a medida que se trasloca a través del poro, se requieren ~ 12 bases para encontrar la secuencia de una base. [30]
Comparación entre tipos
Biológico | De Estado sólido | |
Baja velocidad de translocación | ✓ | |
Reproducibilidad dimensional | ✓ | |
Tolerancia al estrés | ✓ | |
Longevidad | ✓ | |
Facilidad de fabricación | ✓ |
Limitaciones importantes
- Velocidad de traslocación baja: la velocidad a la que una muestra pasa a través del poro de una unidad lo suficientemente lento como para ser medida
- Reproducibilidad dimensional: la probabilidad de que el poro de una unidad tenga el tamaño adecuado.
- Tolerancia al estrés: la sensibilidad de una unidad a las condiciones ambientales internas
- Longevidad: la cantidad de tiempo que se espera que una unidad permanezca funcionando
- Facilidad de fabricación: la capacidad de producir una unidad, generalmente en lo que respecta a la producción en masa
Biológico: ventajas y desventajas.
Los sistemas de secuenciación de nanoporos biológicos tienen varias características fundamentales que los hacen ventajosos en comparación con los sistemas de estado sólido, y cada característica ventajosa de este enfoque de diseño proviene de la incorporación de proteínas en su tecnología. La estructura uniforme de los poros, el control preciso de la translocación de la muestra a través de los canales de los poros e incluso la detección de nucleótidos individuales en las muestras pueden facilitarse mediante proteínas únicas de una variedad de tipos de organismos.
El uso de proteínas en sistemas biológicos de secuenciación de nanoporos, a pesar de los diversos beneficios, también trae consigo algunas características negativas. La sensibilidad de las proteínas en estos sistemas al estrés ambiental local tiene un gran impacto en la longevidad de las unidades, en general. Un ejemplo es que una proteína motora solo puede descomprimir muestras con suficiente velocidad en un cierto rango de pH mientras no opera lo suficientemente rápido fuera del rango; esta restricción afecta la funcionalidad de toda la unidad de secuenciación. Otro ejemplo es que una porina transmembrana solo puede funcionar de manera confiable durante un cierto número de corridas antes de que se descomponga. Ambos ejemplos tendrían que ser controlados en el diseño de cualquier sistema de nanoporos biológico viable, algo que puede ser difícil de lograr mientras se mantienen los costos de dicha tecnología tan bajos y competitivos para otros sistemas como sea posible. [14]
Desafíos
Un desafío para el método de 'secuenciación de cadenas' fue refinar el método para mejorar su resolución para poder detectar bases individuales. En los primeros métodos de los artículos, era necesario repetir un nucleótido en una secuencia aproximadamente 100 veces sucesivamente para producir un cambio característico medible. Esta baja resolución se debe a que la cadena de ADN se mueve rápidamente a una velocidad de 1 a 5 μs por base a través del nanoporo. Esto hace que la grabación sea difícil y propensa al ruido de fondo, por lo que no se obtiene una resolución de un solo nucleótido. El problema se aborda mejorando la tecnología de registro o controlando la velocidad de la cadena de ADN mediante diversas estrategias de ingeniería de proteínas y Oxford Nanopore emplea un 'enfoque kmer', analizando más de una base a la vez para que los tramos de ADN estén sujetos para repetir la interrogación a medida que la hebra se mueve a través del nanoporo una base a la vez. [32] Se han utilizado varias técnicas, incluida la algorítmica, para mejorar el rendimiento de la tecnología MinION desde que se puso a disposición de los usuarios por primera vez. [33] Más recientemente se han demostrado los efectos de las bases individuales debido a la estructura secundaria o los mononucleótidos liberados. [34] [35]
El profesor Hagan Bayley propuso en 2010 que la creación de dos sitios de reconocimiento dentro de un poro de alfa-hemolisina puede conferir ventajas en el reconocimiento de bases. [36]
Un desafío para el 'enfoque de exonucleasa', [37] donde una enzima procesiva alimenta bases individuales, en el orden correcto, en el nanoporo, es integrar la exonucleasa y los sistemas de detección de nanoporos. En particular, [38] el problema es que cuando una exonucleasa hidroliza los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en el ADN, no se garantiza necesariamente que el nucleótido liberado posteriormente se mueva directamente hacia, digamos, un nanoporo de alfa-hemolisina cercano . Una idea es unir la exonucleasa al nanoporo, quizás mediante biotinilación a la hemolisina de barril beta . [38] El poro central de la proteína puede estar revestido con residuos cargados dispuestos de modo que las cargas positivas y negativas aparezcan en lados opuestos del poro. Sin embargo, este mecanismo es principalmente discriminatorio y no constituye un mecanismo para guiar a los nucleótidos por un camino en particular.
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