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 Un microscopio de contraste de fase | |
| Usos | Observación microscópica de material biológico no teñido |
|---|---|
| Inventor | Frits Zernike |
| Fabricante | Leica , Zeiss , Nikon , Olympus y otros |
| Modelo | kgt |
| Artículos relacionados | Contraste de interferencia diferencial microscopía , Hoffman modulación de microscopía de contraste , cuantitativa de contraste de fase microscopía |
La microscopía de contraste de fase es una técnica de microscopía óptica que convierte los cambios de fase en la luz que pasa a través de una muestra transparente en cambios de brillo en la imagen. Los cambios de fase en sí mismos son invisibles, pero se vuelven visibles cuando se muestran como variaciones de brillo.
Cuando las ondas de luz viajan a través de un medio que no es el vacío , la interacción con el medio hace que la amplitud y la fase de la onda cambien de una manera que depende de las propiedades del medio. Los cambios en la amplitud (brillo) surgen de la dispersión y absorción de la luz, que a menudo depende de la longitud de onda y puede dar lugar a colores. Los equipos fotográficos y el ojo humano solo son sensibles a las variaciones de amplitud. Sin disposiciones especiales, los cambios de fase son, por tanto, invisibles. Sin embargo, los cambios de fase a menudo transmiten información importante.
La microscopía de contraste de fases es particularmente importante en biología. Revela muchas estructuras celulares que son invisibles con un microscopio de campo brillante , como se ejemplifica en la figura. Estas estructuras se hicieron visibles a los primeros microscopistas mediante tinción , pero esto requirió una preparación adicional y la muerte de las células. El microscopio de contraste de fase hizo posible que los biólogos estudiaran las células vivas y cómo proliferan a través de la división celular . Es uno de los pocos métodos disponibles para cuantificar la estructura y los componentes celulares que no utiliza fluorescencia . [1] Después de su invención a principios de la década de 1930, [2]La microscopía de contraste de fases demostró ser un avance tan grande en la microscopía que su inventor Frits Zernike recibió el Premio Nobel de Física en 1953. [3]
Principio de funcionamiento [ editar ]
El principio básico para hacer visibles los cambios de fase en la microscopía de contraste de fase es separar la luz de iluminación (de fondo) de la luz dispersa de la muestra (que forma los detalles del primer plano) y manipularlos de manera diferente.
La luz de iluminación en forma de anillo (verde) que pasa por el anillo del condensador se enfoca en la muestra por el condensador. Parte de la luz iluminadora es dispersada por la muestra (amarilla). La luz restante no se ve afectada por la muestra y forma la luz de fondo (roja). Al observar un espécimen biológico sin teñir, la luz dispersada es débil y típicamente desfasada en -90 ° (debido tanto al grosor típico de los especímenes como a la diferencia del índice de refracción entre el tejido biológico y el medio circundante) en relación con la luz de fondo. Esto lleva a que el primer plano (vector azul) y el fondo (vector rojo) tengan casi la misma intensidad, lo que da como resultado un bajo contraste de imagen .
En un microscopio de contraste de fase, el contraste de la imagen aumenta de dos maneras: generando interferencia constructiva entre los rayos de luz dispersos y de fondo en las regiones del campo de visión que contienen la muestra y reduciendo la cantidad de luz de fondo que llega al plano de la imagen. . Primero, la luz de fondo cambia de fase en -90 ° al pasarla a través de un anillo de cambio de fase, lo que elimina la diferencia de fase entre el fondo y los rayos de luz dispersos.
Cuando la luz se enfoca en el plano de la imagen (donde se coloca una cámara o un ocular), este cambio de fase hace que el fondo y los rayos de luz dispersos que se originan en las regiones del campo de visión que contienen la muestra (es decir, el primer plano) interfieran de manera constructiva. , lo que resulta en un aumento en el brillo de estas áreas en comparación con las regiones que no contienen la muestra. Finalmente, el fondo se atenúa ~ 70-90% por un filtro grisanillo; este método maximiza la cantidad de luz dispersa generada por la luz de iluminación (es decir, de fondo), mientras minimiza la cantidad de luz de iluminación que llega al plano de la imagen. Parte de la luz dispersa que ilumina toda la superficie del filtro será desfasada y atenuada por los anillos, pero en mucho menor grado que la luz de fondo, que solo ilumina los anillos de filtro gris y de cambio de fase.
Lo anterior describe el contraste de fase negativo . En su forma positiva , la luz de fondo cambia de fase en + 90 °. La luz de fondo estará desfasada 180 ° con respecto a la luz dispersa. La luz dispersa se restará de la luz de fondo para formar una imagen con un primer plano más oscuro y un fondo más claro, como se muestra en la primera figura. [4] [5] [6]
Métodos relacionados [ editar ]
El éxito del microscopio de contraste de fase ha dado lugar a varios métodos posteriores de obtención de imágenes de fase . En 1952, Georges Nomarski patentó lo que hoy se conoce como microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) . [7] Mejora el contraste creando sombras artificiales, como si el objeto estuviera iluminado desde un lado. Pero la microscopía DIC no es adecuada cuando el objeto o su contenedor alteran la polarización. Con el uso creciente de recipientes de plástico polarizador en biología celular, la microscopía DIC es reemplazada cada vez más por la microscopía de contraste de modulación Hoffman , inventada por Robert Hoffman en 1975. [8]
Los métodos tradicionales de contraste de fase mejoran el contraste ópticamente, combinando el brillo y la información de fase en una sola imagen. Desde la introducción de la cámara digital a mediados de la década de 1990, se han desarrollado varios métodos nuevos de generación de imágenes de fase digital, conocidos colectivamente como microscopía cuantitativa de contraste de fase . Estos métodos crean digitalmente dos imágenes separadas, una imagen ordinaria de campo brillante y una denominada imagen de desplazamiento de fase . En cada punto de la imagen, la imagen de cambio de fase muestra el cambio de fase cuantificado inducido por el objeto, que es proporcional al grosor óptico del objeto. [9]
Ver también [ editar ]
- Imágenes de células vivas
- Imágenes de contraste de fase
- Imágenes de rayos X de contraste de fase
Referencias [ editar ]
- ^ "El microscopio de contraste de fase" . Nobel Media AB.
- ^ Zernike, F. (1955). "Cómo descubrí el contraste de fase". Ciencia . 121 (3141): 345–349. Código Bibliográfico : 1955Sci ... 121..345Z . doi : 10.1126 / science.121.3141.345 . PMID 13237991 .
- ^ "El Premio Nobel de Física 1953" . Nobel Media AB.
- ^ Frits Zernike (1942). "Contraste de fase, un nuevo método para la observación microscópica de objetos transparentes parte I". Physica . 9 (7): 686–698. Código Bibliográfico : 1942Phy ..... 9..686Z . doi : 10.1016 / S0031-8914 (42) 80035-X .
- ^ Frits Zernike (1942). "Contraste de fase, un nuevo método para la observación microscópica de objetos transparentes parte II". Physica . 9 (10): 974–980. Código Bibliográfico : 1942Phy ..... 9..974Z . doi : 10.1016 / S0031-8914 (42) 80079-8 .
- ^ Oscar Richards (1956). "Microscopía de fase 1954-56". Ciencia . 124 (3226): 810–814. Código bibliográfico : 1956Sci ... 124..810R . doi : 10.1126 / science.124.3226.810 .
- ^ US2924142 , Georges Nomarski, "DISPOSITIVO DE POLARIZACIÓN INTERFERENCIAL PARA EL ESTUDIO DE OBJETOS DE FASE"
- ^ US4200354 , Robert Hoffman, "Sistemas de microscopía con iluminación rectangular especialmente adaptados para ver objetos transparentes"
- ^ Kemmler, M .; Fratz, M .; Giel, D .; Saum, N .; Brandeburgo, A .; Hoffmann, C. (2007). "Monitorización de citometría no invasiva dependiente del tiempo por holografía digital". Revista de Óptica Biomédica . 12 (6): 064002. Código Bibliográfico : 2007JBO .... 12f4002K . doi : 10.1117 / 1.2804926 . PMID 18163818 .
Enlaces externos [ editar ]
 | Wikimedia Commons tiene medios relacionados con microscopía de contraste de fase . |
| Recursos de la biblioteca sobre microscopía de contraste de fase |
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- Manual de microscopía óptica: microscopía de contraste de fase de la Universidad Estatal de Florida
- Microscopios de campo oscuro y contraste de fase (Université Paris Sud)
