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Cristales de proteínas cultivados en el transbordador espacial estadounidense o en la estación espacial rusa Mir .

La cristalización de proteínas es el proceso de formación de una matriz regular de moléculas de proteínas individuales estabilizadas por contactos de cristales. Si el cristal está lo suficientemente ordenado, se difractará . Algunas proteínas forman de forma natural matrices cristalinas, como la acuaporina en el cristalino del ojo. [1]

En el proceso de cristalización de proteínas, las proteínas se disuelven en un ambiente acuoso y una solución de muestra hasta que alcanzan el estado sobresaturado . [2] Se utilizan diferentes métodos para alcanzar ese estado, como difusión de vapor, micro lotes, microdiálisis y difusión de interfaz libre. El desarrollo de cristales de proteína es un proceso difícil influenciado por muchos factores, incluido el pH, la temperatura, la fuerza iónica en la solución de cristalización e incluso la gravedad. [2] Una vez formados, estos cristales se pueden utilizar en biología estructural para estudiar la estructura molecular de la proteína, en particular para diversos fines industriales o médicos. [3] [4]

Desarrollo de la cristalización de proteínas [ editar ]

Desde hace más de 150 años, los científicos conocen la cristalización de moléculas de proteínas. [5]

Cristales de hemoglobina SC observados al microscopio.

En 1840, Friedrich Ludwig Hünefeld descubrió accidentalmente la formación de material cristalino en muestras de sangre de lombriz de tierra mantenidas bajo dos portaobjetos de vidrio y ocasionalmente observó pequeños cristales en forma de placas en muestras de sangre humana o porcina desecadas. Estos cristales fueron nombrados como 'hemoglobina' por Felix Hoppe-Seyler en 1864. Los hallazgos seminales de Hünefeld inspiraron a muchos científicos en el futuro. [6]

En 1851, Otto Funke describió el proceso de producción de cristales de hemoglobina humana diluyendo glóbulos rojos con disolventes, como agua pura, alcohol o éter, seguido de la evaporación lenta del disolvente de la solución de proteína. En 1871, William T. Preyer, profesor de la Universidad de Jena, publicó un libro titulado Die Blutkrystalle (Los cristales de sangre), revisando las características de los cristales de hemoglobina de alrededor de 50 especies de mamíferos, aves, reptiles y peces. [6]

En 1909, el fisiólogo Edward T. Reichert, junto con el mineralogista Amos P. Brown, publicaron un tratado sobre la preparación, fisiología y caracterización geométrica de cristales de hemoglobina de varios cientos de animales, incluidas especies extintas como el lobo de Tasmania. [6] Se encontraron cristales de proteína en aumento.

En 1934, John Desmond Bernal y su estudiante Dorothy Hodgkin descubrieron que los cristales de proteína rodeados por su licor madre daban mejores patrones de difracción que los cristales secos. Usando pepsina , fueron los primeros en discernir el patrón de difracción de una proteína globular húmeda. Antes de Bernal y Hodgkin, la cristalografía de proteínas solo se había realizado en condiciones secas con resultados inconsistentes y poco confiables. Este es el primer patrón de difracción de rayos X de un cristal de proteína. [7]

En 1958, la estructura de la mioglobina (una proteína roja que contiene hemo), determinada por cristalografía de rayos X, fue reportada por primera vez por John Kendrew . [8] Kendrew compartió el Premio Nobel de Química de 1962 con Max Perutz por este descubrimiento. [3]

Ahora, basándose en los cristales de proteínas, sus estructuras juegan un papel importante en la bioquímica y la medicina traslacional.

Los fundamentos de la cristalización de proteínas [ editar ]

Cristales de lisozima observados a través de filtro polarizador.

La teoría de la cristalización de proteínas [ editar ]

Lo esencial de la formación de cristales es permitir que la solución de muestra alcance el estado sobresaturado. [2] La sobresaturación está definida por McPherson et al. 2014 como "una condición de desequilibrio en la que una cantidad de la macromolécula que excede el límite de solubilidad, en condiciones químicas y físicas específicas, no obstante está presente en solución". [2] La formación de sólidos en solución, como agregación y cristales, favorece el restablecimiento del equilibrio. El sistema quiere restablecer el equilibrio, por lo que todos los componentes de la expresión energética están al mínimo. [2] Hay tres factores principales involucrados en la expresión de la energía, que son la entalpía (∆H), la entropía (∆S) y la temperatura (T). [9]∆H en esta expresión se relaciona con el ∆H de los enlaces químicos que se forman y rompen en reacciones o cambios de fase. [9] ∆S se relaciona con el grado de libertad o la medida de incertidumbre que pueden tener las moléculas. [9] La espontaneidad de un proceso, la energía libre de Gibb (∆G), se define como ∆G = ∆H- T∆S. [9] Por lo tanto, el aumento de ∆S o la disminución de ∆H contribuye a la espontaneidad del proceso general, haciendo ∆G más negativo, alcanzando así una condición de energía mínima del sistema. [9] Cuando se forman cristales, las moléculas de proteína se vuelven más ordenadas, lo que conduce a una disminución de ∆S y hace que ∆G sea más positivo. [10]Por lo tanto, la cristalización espontánea requiere un ∆H suficientemente negativo para superar la pérdida de entropía del sistema más ordenado. [10]

Una vista molecular que va de la solución al cristal [ editar ]

La formación de cristales requiere dos pasos: nucleación y crecimiento. [2] La nucleación es el paso de inicio de la cristalización. [2] En la fase de nucleación, las moléculas de proteína en solución se unen como agregados para formar un núcleo sólido estable. [2] A medida que se forma el núcleo, el cristal crece cada vez más por las moléculas que se adhieren a este núcleo estable. [2] El paso de nucleación es fundamental para la formación de cristales, ya que es la transición de fase de primer orden de las muestras que pasan de tener un alto grado de libertad a obtener un estado ordenado (acuoso a sólido). [2]Para que el paso de nucleación tenga éxito, la manipulación de los parámetros de cristalización es esencial. El enfoque para lograr que una proteína se cristalice es producir una menor solubilidad de la proteína objetivo en solución. [2] Una vez que se excede el límite de solubilidad y los cristales están presentes, se logra la cristalización. [2]

Métodos de cristalización de proteínas [ editar ]

Difusión de vapor [ editar ]

Tres métodos de preparación de cristales, A: Gota colgante. B: Gota sentada. C: microdiálisis

La difusión de vapor es el método de cristalización de proteínas más comúnmente empleado. En este método, las gotitas que contienen proteína purificada, tampón y precipitante se dejan equilibrar con un depósito más grande que contiene tampones y precipitantes similares en concentraciones más altas. Inicialmente, la gota de solución de proteína contiene concentraciones comparativamente bajas de precipitante y proteína, pero a medida que la gota y el depósito se equilibran, las concentraciones de precipitante y proteína aumentan en la gota. Si se utilizan las soluciones de cristalización adecuadas para una proteína determinada, se produce el crecimiento de cristales en la gota. [11] [12] Este método se utiliza porque permite cambios suaves y graduales en la concentración de proteína y precipitante, lo que ayuda al crecimiento de cristales grandes y bien ordenados.

La difusión de vapor se puede realizar en formato de gota colgante o gota sentada. El aparato para colgar gotas implica una gota de solución de proteína colocada en un cubreobjetos invertido, que luego se suspende sobre el depósito. El aparato de cristalización de gota sentada coloca la gota en un pedestal que está separado del depósito. Ambos métodos requieren sellar el ambiente para que pueda ocurrir el equilibrio entre la gota y el depósito. [11] [13]

Micro lote [ editar ]

Un micro lote generalmente implica sumergir un volumen muy pequeño de gotitas de proteína en aceite (tan solo 1 µl). La razón por la que se requiere aceite es porque se usa un volumen tan bajo de solución de proteína y, por lo tanto, se debe inhibir la evaporación para llevar a cabo el experimento de forma acuosa. Aunque hay varios aceites que pueden usarse, los dos agentes de sellado más comunes son los aceites de parafina (descritos por Chayen et al.) Y los aceites de silicona (descritos por D'Arcy). También existen otros métodos de microbatching que no utilizan un agente de sellado líquido y, en cambio, requieren que un científico coloque rápidamente una película o algo de cinta en una placa con orificios después de colocar la gota en el pocillo.

Además de las cantidades muy limitadas de muestra necesarias, este método también tiene como ventaja adicional que las muestras están protegidas de la contaminación del aire, ya que nunca se exponen al aire durante el experimento.

Microdiálisis [ editar ]

La microdiálisis aprovecha una membrana semipermeable, a través de la cual pueden pasar pequeñas moléculas e iones, mientras que las proteínas y los polímeros grandes no pueden cruzar. Al establecer un gradiente de concentración de soluto a través de la membrana y permitir que el sistema progrese hacia el equilibrio, el sistema puede moverse lentamente hacia la sobresaturación, en cuyo punto se pueden formar cristales de proteína.

La microdiálisis puede producir cristales al salar, empleando altas concentraciones de sal u otros pequeños compuestos permeables a la membrana que disminuyen la solubilidad de la proteína. Muy ocasionalmente, algunas proteínas pueden cristalizarse mediante diálisis, salinándolas, dializándolas contra agua pura, eliminando solutos, impulsando la autoasociación y la cristalización.

Difusión de interfaz libre [ editar ]

Esta técnica reúne proteínas y soluciones de precipitación sin premezclarlas, sino inyectarlas a ambos lados de un canal, lo que permite el equilibrio a través de la difusión. Las dos soluciones entran en contacto en una cámara de reactivo, ambas en sus concentraciones máximas, iniciando la nucleación espontánea. A medida que el sistema se equilibra, el nivel de sobresaturación disminuye, lo que favorece el crecimiento de cristales. [14]

Factores que influyen en la cristalización de proteínas [ editar ]

pH [ editar ]

La fuerza impulsora básica para la cristalización de proteínas es optimizar el número de enlaces que se pueden formar con otra proteína a través de interacciones intermoleculares. [2] Estas interacciones dependen de las densidades de electrones de las moléculas y las cadenas laterales de proteínas que cambian en función del pH. [9] La estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas está determinada por interacciones intermoleculares entre los grupos laterales de los aminoácidos, en los que los grupos hidrófilos suelen mirar hacia el exterior de la solución para formar una capa de hidratación para el disolvente (agua). [9]A medida que cambia el pH, la carga en estos grupos laterales polares también cambia con respecto al pH de la solución y el pKa de la proteína. Por tanto, la elección del pH es fundamental para favorecer la formación de cristales donde la unión entre moléculas entre sí es más favorable que con las moléculas de agua. [9] El pH es una de las manipulaciones más poderosas que se pueden asignar para la condición óptima de cristalización.

Temperatura [ editar ]

La temperatura es otro parámetro interesante para discutir, ya que la solubilidad de las proteínas es función de la temperatura. [15] En la cristalización de proteínas, la manipulación de la temperatura para producir cristales exitosos es una estrategia común. A diferencia del pH, la temperatura de los diferentes componentes de los experimentos de cristalografía podría afectar los resultados finales, como la temperatura de preparación del tampón, [16] la temperatura del experimento de cristalización real, etc.

Aditivos químicos [ editar ]

Los aditivos químicos son pequeños compuestos químicos que se agregan al proceso de cristalización para aumentar el rendimiento de cristales. [17] El papel de las moléculas pequeñas en la cristalización de proteínas no se había pensado bien en los primeros días, ya que se pensaba que eran contaminantes en la mayoría de los casos. [17] Las moléculas más pequeñas cristalizan mejor que las macromoléculas como las proteínas, por lo que el uso de aditivos químicos se había limitado antes del estudio de McPherson. Sin embargo, este es un aspecto poderoso de los parámetros experimentales para la cristalización que es importante que los bioquímicos y cristalógrafos investiguen y apliquen más. [17]

Tecnologías que ayudan a la cristalización de proteínas [ editar ]

Cribado de cristalización de alto rendimiento [18] [ editar ]

Existen métodos de alto rendimiento para ayudar a agilizar la gran cantidad de experimentos necesarios para explorar las diversas condiciones que son necesarias para el crecimiento exitoso de cristales. Hay numerosos kits comerciales disponibles para pedido que aplican ingredientes preensamblados en sistemas garantizados para producir una cristalización exitosa. Con este equipo, un científico evita la molestia de purificar una proteína y determinar las condiciones de cristalización adecuadas.

Los robots de manipulación de líquidos se pueden utilizar para configurar y automatizar una gran cantidad de experimentos de cristalización simultáneamente. Lo que de otro modo sería un proceso lento y potencialmente propenso a errores llevado a cabo por un ser humano, puede lograrse de manera eficiente y precisa con un sistema automatizado. Los sistemas de cristalización robótica utilizan los mismos componentes descritos anteriormente, pero realizan cada paso del procedimiento de forma rápida y con un gran número de réplicas. Cada experimento utiliza pequeñas cantidades de solución, y la ventaja del tamaño más pequeño es doble: los tamaños de muestra más pequeños no solo reducen el gasto de proteína purificada, sino que cantidades más pequeñas de solución conducen a cristalizaciones más rápidas. Cada experimento es monitoreado por una cámara que detecta el crecimiento de cristales. [12]

Ingeniería de proteínas [ editar ]

Las proteínas se pueden diseñar para mejorar la posibilidad de una cristalización de proteínas exitosa mediante el uso de técnicas como la Reducción de Entropía de Superficie [19] o la ingeniería en contactos de cristales. [20] Con frecuencia, los residuos de cisteína problemáticos se pueden reemplazar por alanina para evitar la agregación mediada por disulfuro , y los residuos como lisina, glutamato y glutamina se pueden cambiar a alanina para reducir la flexibilidad intrínseca de la proteína, lo que puede dificultar la cristalización.

Aplicaciones de la cristalografía de proteínas [ editar ]

Las estructuras macromoleculares se pueden determinar a partir de cristales de proteínas utilizando una variedad de métodos, incluida la difracción de rayos X / cristalografía de rayos X , la microscopía electrónica criogénica (CryoEM) (incluida la cristalografía electrónica y la difracción electrónica de microcristales (MicroED) ), rayos X de ángulo pequeño dispersión y difracción de neutrones . Véase también Biología estructural .

La cristalización de proteínas también puede ser útil en la formulación de proteínas con fines farmacéuticos. [21]

Ver también [ editar ]

  • Ingeniería de cristal
  • Crecimiento de cristales
  • Óptica de cristal
  • Sistema de cristal
  • Procesos de cristalización
  • Base de datos cristalográfica
  • Grupo cristalográfico
  • Difracción
  • Cristalografía electrónica
  • Difracción de electrones
  • Cristalografía de neutrones
  • Difracción de neutrones
  • Biología estructural
  • difracción de rayos X

Referencias [ editar ]

  1. ^ Schey, Kevin L .; Wang, Zhen; L. Wenke, Jamie; Qi, Ying (mayo de 2014). "Acuaporinas en el ojo: expresión, función y roles en la enfermedad ocular" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Temas generales . 1840 (5): 1513-1523. doi : 10.1016 / j.bbagen.2013.10.037 . PMC  4572841 . PMID  24184915 .
  2. ^ a b c d e f g h i j k l m McPherson, Alexander; Gavira, José A. (24 de diciembre de 2013). "Introducción a la cristalización de proteínas" . Acta Crystallographica Sección F . 70 (1): 2–20. doi : 10.1107 / s2053230x13033141 . ISSN 2053-230X . PMC 3943105 . PMID 24419610 .   
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  4. ^ Tripatía, Debu; Bardia, Aditya; Vendedores, William R. (28 de marzo de 2017). "Ribociclib (LEE011): mecanismo de acción e impacto clínico de este inhibidor selectivo de quinasa 4/6 dependiente de ciclina en varios tumores sólidos" . Investigación clínica del cáncer . 23 (13): 3251–3262. doi : 10.1158 / 1078-0432.ccr-16-3157 . ISSN 1078-0432 . PMC 5727901 . PMID 28351928 .   
  5. ^ McPherson, Alexander (marzo de 1991). "Una breve historia del crecimiento de cristales de proteínas". Diario de crecimiento cristalino . 110 (1–2): 1–10. Código bibliográfico : 1991JCrGr.110 .... 1M . doi : 10.1016 / 0022-0248 (91) 90859-4 . ISSN 0022-0248 . 
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Enlaces externos [ editar ]

  • "Cristalización de proteínas y suerte tonta". Un ensayo sobre el lado fortuito de la cristalización de proteínas de Bob Cudney: http://www.rigaku.com/downloads/journal/Vol16.2.1999/cudney.pdf
  • Owens, Ray. "Cristales de proteínas" . Ciencia entre bastidores . Brady Haran .
  • Esta página fue reproducida (con modificaciones) con el consentimiento expreso del Dr. A. Malcolm Campbell. A partir de 2010, la página original se puede encontrar en http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Kogoy/protein.html