Apagado (fluorescencia)
La extinción se refiere a cualquier proceso que disminuya la intensidad de fluorescencia de una sustancia dada. Una variedad de procesos pueden dar como resultado el enfriamiento, como reacciones en estado excitado , transferencia de energía, formación de complejos y enfriamiento por colisión. Como consecuencia, el enfriamiento suele depender en gran medida de la presión y la temperatura . El oxígeno molecular , los iones de yoduro y la acrilamida [1] son inhibidores químicos comunes. El ion cloruro es un extintor bien conocido de la fluorescencia de la quinina. [2] [3] [4] La extinción plantea un problema para los métodos espectroscópicos no instantáneos, comofluorescencia inducida por láser .
El enfriamiento se utiliza en sensores de optodos ; por ejemplo, el efecto inhibidor del oxígeno en ciertos complejos de rutenio permite medir la saturación de oxígeno en solución. La extinción es la base de los ensayos de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster. [5] [6] [7] La extinción y la desactivación tras la interacción con un objetivo biológico molecular específico es la base de los agentes de contraste óptico activables para la obtención de imágenes moleculares . [8] [9] Muchos colorantes se apagan automáticamente, lo que puede disminuir el brillo de los conjugados de proteína y colorante para microscopía de fluorescencia , [10]o puede ser potenciado en sensores de proteólisis . [11]
Existen algunos mecanismos distintos por los cuales la energía se puede transferir de forma no radiativa (sin absorción o emisión de fotones) entre dos colorantes, un donante y un aceptor. La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET o FET) es un mecanismo de extinción dinámico porque la transferencia de energía ocurre mientras el donante está en estado excitado. FRET se basa en las interacciones clásicas dipolo-dipolo entre los dipolos de transición del donante y el aceptor y depende en gran medida de la distancia donante-aceptor, R , cayendo a una tasa de 1/ R 6. FRET también depende de la superposición espectral donante-aceptor (ver figura) y la orientación relativa de los momentos dipolares de transición donante y aceptor. FRET normalmente puede ocurrir en distancias de hasta 100 Å.
Dexter (también conocido como intercambio Dexter o transferencia de energía por colisión, coloquialmente conocido como transferencia de energía D exter ) es otro mecanismo de extinción dinámico. [12] La transferencia de electrones Dexter es un fenómeno de corto alcance que disminuye exponencialmente con la distancia (proporcional a e − kR donde k es una constante que depende de la inversa del radio de van der Waals del átomo [ cita requerida ]) y depende de la superposición espacial de los orbitales moleculares donante y extintor. En la mayoría de las situaciones de donante-fluoróforo-apagador-aceptor, el mecanismo de Förster es más importante que el mecanismo de Dexter. Con la transferencia de energía de Förster y Dexter, las formas de los espectros de absorción y fluorescencia de los tintes no cambian.
La transferencia de electrones Dexter puede ser significativa entre el tinte y el solvente, especialmente cuando se forman enlaces de hidrógeno entre ellos.
El mecanismo de transferencia de energía restante es el enfriamiento estático (también conocido como enfriamiento por contacto). El apagado estático puede ser un mecanismo dominante para algunas sondas reportero-apagador. A diferencia del enfriamiento dinámico, el enfriamiento estático ocurre cuando las moléculas forman un complejo en el estado fundamental, es decir, antes de que ocurra la excitación. El complejo tiene sus propias propiedades únicas, como no ser fluorescente y tener un espectro de absorción único . La agregación del tinte a menudo se debe a efectos hidrofóbicos : las moléculas del tinte se apilan para minimizar el contacto con el agua. Los tintes aromáticos planares que se emparejan para la asociación a través de fuerzas hidrofóbicas pueden mejorar el enfriamiento estático. Las altas temperaturas y la adición de tensioactivos tienden a interrumpir la formación de complejos en estado fundamental.
