Imágenes de fluctuación óptica de súper resolución
La imagen de fluctuación óptica de súper resolución (SOFI) es un método de posprocesamiento para el cálculo de imágenes de súper resolución a partir de series de tiempo de imágenes grabadas que se basa en las correlaciones temporales de emisores fluorescentes que fluctúan independientemente.
SOFI se ha desarrollado para la superresolución de muestras biológicas que están marcadas con emisores fluorescentes que fluctúan independientemente (tintes orgánicos, proteínas fluorescentes ). En comparación con otras técnicas de microscopía de súper resolución como STORM o PALM que se basan en la localización de una sola molécula y, por lo tanto, solo permiten una molécula activa por área limitada por difracción (DLA) y punto de tiempo, [1] [2] SOFI no necesita un fotoconmutación y / o fotoactivación controladas , así como tiempos de captura de imágenes prolongados. [3] [4]Sin embargo, todavía requiere fluoróforos que estén en ciclo a través de dos estados distinguibles, ya sean estados de encendido / apagado reales o estados con diferentes intensidades de fluorescencia. En términos matemáticos, las imágenes SOFI se basan en el cálculo de acumulados , por lo que existen dos formas distinguibles. Por un lado, una imagen se puede calcular mediante auto-acumuladores [3] que, por definición, solo se basan en la información de cada píxel en sí, y por otro, un método mejorado utiliza la información de diferentes píxeles mediante el cálculo de acumuladores cruzados. [5] Ambos métodos pueden aumentar significativamente la resolución de la imagen final, aunque el cálculo acumulativo tiene sus limitaciones. De hecho, SOFI puede aumentar la resolución en las tres dimensiones. [3]
Al igual que otros métodos de superresolución, SOFI se basa en la grabación de una serie temporal de imágenes en una cámara CCD o CMOS. A diferencia de otros métodos, la serie de tiempo registrada puede ser sustancialmente más corta, ya que no se requiere una localización precisa de los emisores y, por lo tanto, se permite una mayor cantidad de fluoróforos activados por área limitada por difracción. Los valores de píxeles de una imagen SOFI de n -ésimo orden se calculan a partir de los valores de la serie temporal de píxeles en forma de un n -ésimo orden acumulativo, mientras que el valor final asignado a un píxel se puede imaginar como la integral sobre una función de correlación. Las intensidades de valor de píxel finalmente asignadas son una medida del brillo y la correlación de la señal de fluorescencia. Matemáticamente, la nEl acumulador de -ésimo orden está relacionado con la función de correlación de n -ésimo orden, pero presenta algunas ventajas con respecto a la resolución resultante de la imagen. Dado que en SOFI se permiten varios emisores por DLA, el recuento de fotones en cada píxel resulta de la superposición de las señales de todos los emisores cercanos activados. El cálculo acumulativo ahora filtra la señal y deja solo fluctuaciones altamente correlacionadas. Esto proporciona una mejora del contraste y, por lo tanto, una reducción del fondo en buena medida. Como está implícito en la figura de la izquierda, la distribución de la fuente de fluorescencia:
se convoluciona con la función de dispersión de puntos del sistema (PSF) U ( r ). Por tanto, la señal de fluorescencia en el tiempo ty la posición viene dada por
