La microscopía de tres fotones (3PEF) es una microscopía de fluorescencia de alta resolución basada en un efecto de excitación no lineal. [1] [2] [3] A diferencia de la microscopía de excitación de dos fotones , utiliza tres fotones excitantes. Por lo general, utiliza un láser de longitud de onda de 1300 nm o más para excitar los tintes fluorescentes con tres fotones absorbidos simultáneamente, y luego los tintes fluorescentes emiten un fotón cuya energía es (ligeramente menor que) tres veces la energía de cada fotón incidente. En comparación con la microscopía de dos fotones, la microscopía de tres fotones reduce la fluorescencia del plano focal al, que es mucho más rápido que el de la microscopía de dos fotones por . [4] Además, la microscopía de tres fotones emplea luz del infrarrojo cercano con menos efecto de dispersión del tejido , lo que hace que la microscopía de tres fotones tenga una resolución más alta que la microscopía convencional .
Concepto
La fluorescencia excitada por tres fotones fue observada por primera vez por Singh y Bradley en 1964 cuando estimaron la sección transversal de absorción de tres fotones de los cristales de naftaleno. [5] En 1996, Stefan W. Hell diseñó experimentos para validar la viabilidad de aplicar la excitación de tres fotones a la microscopía de fluorescencia de barrido, lo que demostró aún más el concepto de fluorescencia excitada por tres fotones. [6]
La microscopía de tres fotones comparte algunas similitudes con la microscopía de excitación de dos fotones . Ambos emplean el método de escaneo puntual; Ambos pueden obtener imágenes de muestras en 3D ajustando la posición de la lente de enfoque a lo largo de las direcciones axial y lateral; Las estructuras de ambos sistemas no requieren un orificio para bloquear la luz fuera de foco. Sin embargo, la microscopía de tres fotones se diferencia de la microscopía de excitación de dos fotones en su función de dispersión de puntos , resolución , profundidad de penetración, resistencia a la luz fuera de foco y fuerza del fotoblanqueo .
En la excitación de tres fotones, el fluoróforo absorbe tres fotones casi simultáneamente. La longitud de onda del láser de excitación es de aproximadamente 1200 nm o más en microscopía de tres fotones con la longitud de onda de emisión un poco más larga que un tercio de la longitud de onda de excitación. La microscopía de tres fotones tiene una penetración tisular más profunda debido a las longitudes de onda de excitación más largas y la excitación no lineal de orden superior. Sin embargo, el microscopio de tres fotones necesita el láser con mayor potencia debido a la sección transversal relativamente más pequeña de los tintes para la excitación de tres fotones, que es del orden de, que es mucho más pequeño que las secciones transversales típicas de excitación de dos fotones de . [7] Los pulsos ultracortos suelen rondar los 100 fs.
Resolución
Para microscopía de barrido de fluorescencia de tres fotones, la función de dispersión de puntos de intensidad tridimensional (IPSF) se puede denotar como,
- , [8]
dónde denota la operación de convolución 3-D, denota la sensibilidad a la intensidad de un detector incoherente, y , denota el IPSF 3-D para la lente del objetivo y la lente colectora en fluorescencia de fotón único, respectivamente. El IPSF 3-D se puede expresar en
- , [8]
dónde es una función de Bessel de primer tipo de orden cero. Las coordenadas axiales y radiales y están definidos por
- y
- , [8]
dónde es la apertura numérica de la lente del objetivo, es el desenfoque real, y son las coordenadas radiales.
Acoplamiento con otras técnicas multifotónicas
Se pueden obtener imágenes correlativas utilizando diferentes esquemas multifotónicos como 2PEF , 3PEF y Tercera generación armónica (THG), en paralelo (dado que las longitudes de onda correspondientes son diferentes, se pueden separar fácilmente en diferentes detectores). Luego se construye una imagen multicanal. [9]
3PEF también se compara con 2PEF : generalmente da una menor degradación de la relación señal / fondo (SBR) con la profundidad, incluso si la señal emitida es más pequeña que con 2PEF. [9]
Desarrollo
Después de que Singh y Bradley observaron la fluorescencia excitada por tres fotones y Hell la validaron, Chris Xu informó la medición de las secciones transversales de excitación de varios cromóforos nativos e indicadores biológicos, e implementó la fluorescencia excitada por tres fotones en la microscopía de barrido láser de células vivas. [10] En noviembre de 1996, David Wokosin aplicó fluorescencia de excitación de tres fotones para obtener imágenes de muestras biológicas fijas in vivo.
En la década de 2010, se aplicó la microscopía de tres fotones para obtener imágenes de tejidos profundos utilizando longitudes de onda de excitación superiores a 1060 nm. En enero de 2013, Horton, Wang y Kobat inventaron imágenes profundas in vivo de un cerebro de ratón intacto empleando el método de escaneo puntual en un microscopio de tres fotones en la ventana de longitud de onda larga de 1700 nm. [4] En febrero de 2017, Dimitre Ouzounov y Tainyu Wang demostraron imágenes de actividad profunda de neuronas marcadas con GCaMP6 en el hipocampo de un cerebro de ratón adulto intacto utilizando microscopía de tres fotones en la ventana de longitud de onda de 1300 nm. [11] En mayo de 2017, Rowlands aplicó excitación de tres fotones de campo amplio a un microscopio de tres fotones para una mayor profundidad de penetración. [12] En octubre de 2018, T Wang, D Ouzounov y C Xu pudieron obtener imágenes de la vasculatura y la actividad del calcio GCaMP6 utilizando tres microscopios de fotones a través del cráneo intacto del ratón. [13]
Aplicaciones
La microscopía de tres fotones tiene campos de aplicación similares con la microscopía de excitación de dos fotones, incluida la neurociencia [14] y la oncología. [15] Sin embargo, en comparación con la excitación estándar de un solo fotón o dos fotones, la excitación de tres fotones tiene varios beneficios, como el uso de longitudes de onda más largas reduce los efectos de la dispersión de la luz y aumenta la profundidad de penetración del haz de iluminación en la muestra. [16] La naturaleza no lineal de la microscopía de tres fotones confina el objetivo de excitación a un volumen más pequeño, reduciendo la luz fuera de foco y minimizando el fotoblanqueo en la muestra biológica. [16] Estas ventajas de la microscopía de tres fotones le dan una ventaja en la visualización de la morfología y fisiología del tejido in vivo y ex vivo a un nivel celular profundo dentro del tejido de dispersión [4] y la obtención de imágenes volumétricas rápidas. [17] En el estudio reciente, Xu ha demostrado el potencial de las imágenes de tres fotones para estudios no invasivos de sistemas biológicos vivos. [13] El artículo utilizó microscopía de fluorescencia de tres fotones en una ventana de excitación espectral de 1320 nm para obtener imágenes de la estructura y función del cerebro del ratón a través del cráneo intacto con alta resolución espacial y temporal (la FWHM lateral y axial fue de 0,96 μm y 4,6 μm) y campos de visión grandes (cientos de micrómetros), y a una profundidad sustancial (> 500 μm). Este trabajo demuestra la ventaja de la excitación no lineal de orden superior para obtener imágenes a través de una capa de alta dispersión, que se suma a la ventaja informada anteriormente de 3PM para imágenes profundas de muestras densamente etiquetadas.
Ver también
Referencias
- ^ Horton, Nicholas G .; Wang, Ke; Kobat, Demirhan; Clark, Catharine G .; Wise, Frank W .; Schaffer, Chris B .; Xu, Chris (1 de marzo de 2013). "Microscopía de tres fotones in vivo de estructuras subcorticales dentro de un cerebro de ratón intacto" . Nature Photonics . 7 (3): 205-209. Código Bibliográfico : 2013NaPho ... 7..205H . doi : 10.1038 / nphoton.2012.336 . PMC 3864872 . PMID 24353743 .
- ^ Chen, Bingying; Huang, Xiaoshuai; Gou, Dongzhou; Zeng, Jianzhi; Chen, Guoqing; Pang, Meijun; Hu, Yanhui; Zhao, Zhe; Zhang, Yunfeng (29 de marzo de 2018). "Imagen volumétrica rápida con microscopía de tres fotones Bessel-Beam" . Óptica Biomédica Express . 9 (4): 1992–2000. doi : 10.1364 / BOE.9.001992 . PMC 5905939 . PMID 29675334 .
- ^ Williams, Rebecca M .; Shear, Jason B .; Zipfel, Warren R .; Maiti, Sudipta; Webb, Watt W. (1 de abril de 1999). "Procesos de secreción de mastocitos mucosos fotografiados mediante microscopía de tres fotones de autofluorescencia de 5-hidroxitriptamina" . Revista biofísica . 76 (4): 1835–1846. Código bibliográfico : 1999BpJ .... 76.1835W . doi : 10.1016 / S0006-3495 (99) 77343-1 . PMC 1300160 . PMID 10096882 .
- ^ a b c Horton, Nicholas; Wang, Ke; Kobat, Demirhan; Clark, Catharine; Sabio, Frank; Schaffer, Chris; Xu, Chris (20 de enero de 2013). "Microscopía de tres fotones in vivo de estructuras subcorticales dentro de un cerebro de ratón intacto" . Nature Photonics . 7 (3): 205-209. Código Bibliográfico : 2013NaPho ... 7..205H . doi : 10.1038 / nphoton.2012.336 . PMC 3864872 . PMID 24353743 .
- ^ Singh, S .; Bradley, LT (1 de junio de 1964). "Absorción de tres fotones en cristales de naftaleno por excitación láser". Cartas de revisión física . 12 (22): 612–614. Código Bibliográfico : 1964PhRvL..12..612S . doi : 10.1103 / PhysRevLett.12.612 .
- ^ Infierno, SW; Bahlmann, K; Schrader, M; Soini, A; Malak, HM; Gryczynski, yo; Lakowicz, JR (1 de enero de 1996). "Excitación de tres fotones en microscopía de fluorescencia" . Revista de Óptica Biomédica . 1 (1): 71–74. Bibcode : 1996JBO ..... 1 ... 71H . doi : 10.1117 / 12.229062 . PMID 23014645 .
- ^ Toda, Keisuke; Isobe, Keisuke; Namiki, Kana; Kawano, Hiroyuki; Miyawaki, Atsushi; Midorikawa, Katsumi (junio de 2017). "Microscopía de enfoque temporal utilizando fluorescencia de excitación de tres fotones con un amplificador de pulso de fibra Yb de 92 fs" . Óptica Biomédica Express . 8 (6): 2796–2806. doi : 10.1364 / BOE.8.002796 . PMC 5480430 . PMID 28663907 .
- ^ a b c Gu, Min (1 de julio de 1996). "Resolución en microscopía de barrido de fluorescencia de tres fotones". Letras de óptica . 21 (13): 988–990. Código Bibliográfico : 1996OptL ... 21..988G . doi : 10.1364 / OL.21.000988 . PMID 19876227 .
- ^ a b Guesmi, Khmaies; Abdeladim, Lamiae; Tozer, Samuel; Mahou, Pierre; Kumamoto, Takuma; Jurkus, Karolis; Rigaud, Philippe; Loulier, Karine; Dray, Nicolas; Georges, Patrick; Hanna, Marc; Livet, Jean; Supatto, Willy; Beaurepaire, Emmanuel; Druon, Frédéric (2018). "Microscopía de tres fotones de tejido profundo de dos colores con un láser infrarrojo multibanda" . Luz: ciencia y aplicaciones . 7 (1): 12. Bibcode : 2018LSA ..... 7 ... 12G . doi : 10.1038 / s41377-018-0012-2 . ISSN 2047-7538 . PMC 6107000 . PMID 30839589 .
- ^ Xu, C; Zipfel, W; Shear, JB; Williams, RM; Webb, WW (1 de octubre de 1996). "Excitación de fluorescencia multifotónica: nuevas ventanas espectrales para microscopía biológica no lineal" . Proc Natl Acad Sci USA . 93 (20): 10763–10768. Código bibliográfico : 1996PNAS ... 9310763X . doi : 10.1073 / pnas.93.20.10763 . PMC 38229 . PMID 8855254 .
- ^ Ouzounov, Dimitre; Wang, Tianyu; Wang, Mengran; Feng, Danielle; Horton, Nicholas; Cruz-Hernández, Jean; Cheng, Yuting; Reimer, Jacob; Tolias, Andreas; Nishimura, Nozomi; Xu, Chris (20 de febrero de 2017). "Imagen de tres fotones in vivo de la actividad de las neuronas marcadas con GCaMP6 en lo profundo del cerebro intacto del ratón" . Métodos de la naturaleza . 14 (4): 388–390. doi : 10.1038 / nmeth.4183 . PMC 6441362 . PMID 28218900 .
- ^ Rowlands, Christopher; Park, Demian; Bruns, Oliver; Piatkevich, Kiryl; Fukumura, Dai; Jain, Rakesh; Bawendi, Moungi; Boyden, Edward; Entonces, Peter (5 de mayo de 2017). "Excitación de tres fotones de campo amplio en muestras biológicas" . Luz: ciencia y aplicaciones . 6 (5): e16255. Código Bib : 2017LSA ..... 6E6255R . doi : 10.1038 / lsa.2016.255 . PMC 5687557 . PMID 29152380 . ProQuest 1917694404 .
- ^ a b Wang, Tianyu; Ouzounov, Dimitre; Wu, Chunyan; Horton, Nicholas; Zhang, Bin; Wu, Cheng-Hsun; Zhang, Yanping; Schnitzer, Mark; Xu, Chris (10 de septiembre de 2018). "Imagen de tres fotones de la estructura y función del cerebro del ratón a través del cráneo intacto" . Métodos de la naturaleza . 15 (10): 789–792. doi : 10.1038 / s41592-018-0115-y . PMC 6188644 . PMID 30202059 .
- ^ Kerr, Jason; Denk, Winfried (marzo de 2008). "Imágenes in vivo: observar el cerebro en acción". Nature Reviews Neurociencia . 9 (3): 195-205. doi : 10.1038 / nrn2338 . PMID 18270513 . S2CID 6301173 .
- ^ Williams, Rebecca M .; Flesken-Nikitin, Andrea; Ellenson, Lora Hedrick; Connolly, Denise C .; Hamilton, Thomas C .; Nikitin, Alexander Yu .; Zipfel, Warren R. (junio de 2010). "Estrategias para la obtención de imágenes de alta resolución del cáncer de ovario epitelial mediante microscopía no lineal laparoscópica" . Oncología traslacional . 3 (3): 181-194. doi : 10.1593 / tlo.09310 . PMC 2887648 . PMID 20563260 .
- ^ a b Escobet-Montalbán, Adrià; Gasparoli, Federico M .; Nylk, Jonathan; Liu, Pengfei; Yang, Zhengyi; Dholakia, Kishan (octubre de 2018). "Microscopía de fluorescencia de hoja de luz de tres fotones". Letras de óptica . 43 (21): 5484–5487. Código bibliográfico : 2018OptL ... 43.5484E . doi : 10.1364 / ol.43.005484 . hdl : 10023/18816 . PMID 30383037 .
- ^ Chen, Bingying; Huang, Xiaoshuai; Gou, Dongzhou; Zeng, Jianzhi; Chen, Guoqing; Pang, Meijun; Hu, Yanhui; Zhao, Zhe; Zhang, Yunfeng; Zhou, Zhuan; Wu, Haitao; Cheng, Heping; Zhang, Zhigang; Xu, Chris; Li, Yulong; Chen, Liangyi; Wang, Aimin (abril de 2018). "Imagen volumétrica rápida con microscopía de tres fotones Bessel-Beam" . Óptica Biomédica Express . 9 (4): 1992–2000. doi : 10.1364 / boe.9.001992 . PMC 5905939 . PMID 29675334 .