En óptica , el fotoblanqueo (a veces denominado desvanecimiento) es la alteración fotoquímica de un tinte o una molécula de fluoróforo de modo que permanentemente no puede emitir fluorescencia. Esto es causado por la escisión de enlaces covalentes o reacciones inespecíficas entre el fluoróforo y las moléculas circundantes. [1] Tales modificaciones irreversibles en los enlaces covalentes son causadas por la transición de un estado singlete al estado triplete de los fluoróforos. El número de ciclos de excitación para lograr un blanqueo completo varía. En microscopía, el fotoblanqueo puede complicar la observación de moléculas fluorescentes, ya que eventualmente serán destruidas por la exposición a la luz necesaria para estimularlas a fluorescentes. Esto es especialmente problemático en la microscopía de lapso de tiempo .
Sin embargo, el fotoblanqueo también se puede usar antes de aplicar las moléculas fluorescentes (principalmente unidas a anticuerpos ), en un intento de apagar la autofluorescencia . Esto puede ayudar a mejorar la relación señal / ruido .
El fotoblanqueo también se puede explotar para estudiar el movimiento y / o difusión de moléculas, por ejemplo a través del FRAP , en el que el movimiento de los componentes celulares puede confirmarse observando una recuperación de la fluorescencia en el sitio del fotoblanqueo, o técnicas FLIP , en las que múltiples Se realizan rondas de fotoblanqueo para que se pueda observar la propagación de la pérdida de fluorescencia en la célula.
La pérdida de actividad causada por el fotoblanqueo se puede controlar reduciendo la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, aumentando la concentración de fluoróforos, reduciendo la frecuencia y, por lo tanto, la energía fotónica de la luz de entrada, o empleando fluoróforos más robustos que son menos propensos al blanqueamiento (por ejemplo, tintes de cianina, Alexa Fluors o DyLight Fluors , AttoDyes, Janelia Dyes y otros). En una aproximación razonable, una molécula dada será destruida después de una exposición constante (intensidad de emisión X tiempo de emisión X número de ciclos) porque, en un ambiente constante, cada ciclo de absorción-emisión tiene la misma probabilidad de causar fotoblanqueo.
El fotoblanqueo es un parámetro importante a tener en cuenta en las imágenes de fluorescencia de una sola molécula en tiempo real en biofísica. A las intensidades de luz utilizadas en las imágenes de fluorescencia de una sola molécula (0,1-1 kW / cm2 en configuraciones experimentales típicas), incluso los fluoróforos más robustos continúan emitiendo hasta 10 segundos antes del fotoblanqueo en un solo paso. Para algunos tintes, la vida útil se puede prolongar de 10 a 100 veces utilizando sistemas de captación de oxígeno (hasta 1000 segundos con optimización de los parámetros de imagen y la relación señal-ruido). Por ejemplo, una combinación de ácido protocatecuico (PCA) y protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD) se usa a menudo como sistema de captación de oxígeno, y eso aumenta la vida útil de la fluorescencia en más de un minuto.
Dependiendo de su química específica, las moléculas pueden fotoblanquearse después de absorber solo unos pocos fotones, mientras que las moléculas más robustas pueden sufrir muchos ciclos de absorción / emisión antes de su destrucción:
- Proteína verde fluorescente : 10 4 –10 5 fotones; Vida útil de 0,1 a 1,0 segundos.
- Colorante orgánico típico: 10 5 –10 6 fotones; Vida útil de 1 a 10 segundos.
- Punto cuántico CdSe / ZnS : 108 fotones; > 1000 segundos de vida útil.
Este uso del término "vida útil" no debe confundirse con la "vida útil" medida por imágenes de vida útil de fluorescencia .
Ver también
Referencias
enlaces externos
- Introducción a la microscopía óptica un artículo sobre fotoblanqueo
- Viegas MS; Martins TC; Seco F; hacer Carmo A (2007). "Una metodología mejorada y rentable para la reducción de la autofluorescencia en estudios de inmunofluorescencia directa en tejidos embebidos en parafina fijados con formalina". Eur J Histochem . 51 (1): 59–66. PMID 17548270 .