La cristalografía resuelta en el tiempo utiliza imágenes de cristalografía de rayos X para visualizar reacciones en cuatro dimensiones (x, y, zy tiempo). Esto permite el estudio de los cambios dinámicos que se producen, por ejemplo, en las enzimas durante su catálisis. La dimensión de tiempo se incorpora activando la reacción de interés en el cristal antes de la exposición a los rayos X , y luego recolectando los patrones de difracción en diferentes retrasos de tiempo. Para estudiar estas propiedades dinámicas de las macromoléculas se deben cumplir tres criterios; [1]
- La macromolécula debe ser biológicamente activa en estado cristalino.
- Debe ser posible desencadenar la reacción en el cristal.
- El intermedio de interés debe ser detectable, es decir, debe tener una concentración razonable en el cristal (preferiblemente superior al 25%).
Esto ha llevado al desarrollo de varias técnicas que se pueden dividir en dos grupos, el método de bomba-sonda y los métodos de captura por difusión.
Sonda de bomba
En el método de bomba-sonda, la reacción se desencadena primero (bombeo) mediante fotólisis (la mayoría de las veces con luz láser) y luego se recoge un patrón de difracción mediante un pulso de rayos X (sonda) con un retraso de tiempo específico. Esto hace posible obtener muchas imágenes en diferentes retrasos de tiempo después de la activación de la reacción y, por lo tanto, construir una serie cronológica de imágenes que describen los eventos durante la reacción. Para obtener una relación señal / ruido razonable, este ciclo de bomba-sonda debe realizarse muchas veces para cada rotación espacial del cristal y muchas veces para el mismo retardo de tiempo. Por lo tanto, la reacción que se desea estudiar con la bomba-sonda debe poder volver a relajarse a su conformación original después de la activación, lo que permite realizar muchas mediciones en la misma muestra. La resolución temporal de los fenómenos observados viene dictada por el ancho de tiempo del pulso de sondeo ( ancho completo a la mitad del máximo ). Todos los procesos que suceden en una escala de tiempo más rápida que esa serán promediados por la convolución de la intensidad del pulso de la sonda en el tiempo con la intensidad de la reflectividad de rayos X real de la muestra.
Atrapamiento por difusión
Los métodos de captura por difusión utilizan técnicas de difusión para introducir los sustratos en el cristal y, posteriormente, se aplican diferentes técnicas de captura para conseguir que el intermedio de interés se acumule en el cristal antes de la recogida del patrón de difracción. Estos métodos de captura podrían involucrar cambios en el pH , [2] el uso de inhibidor [3] o bajar la temperatura para ralentizar la tasa de renovación o incluso detener la reacción por completo en un paso específico. También es un método posible comenzar la reacción y luego congelarla rápidamente, [4] apagándola en un paso de tiempo específico. Un inconveniente de los métodos de captura por difusión es que solo se pueden utilizar para estudiar intermedios que pueden quedar atrapados, lo que limita el tiempo de resolución que se puede obtener a través de los métodos en comparación con el método de bomba-sonda.
Ver también
Referencias
- ^ Hajdu, J; Neutze, R; Sjögren, T; Edman, K; Szöke, A; Wilmouth, RC; Wilmot, CM (2000). "Análisis de funciones de proteínas en cuatro dimensiones". Biología estructural de la naturaleza . 7 (11): 1006–12. doi : 10.1038 / 80911 . PMID 11062553 .
- ^ Yamashita, Atsuko; Endo, Masaharu; Higashi, Tsuneyuki; Nakatsu, Toru; Yamada, Yasuyuki; Oda, Jun'Ichi; Kato, Hiroaki (2003). "Captura de la estructura de la enzima antes del inicio de la reacción: complejos de sustrato de reductasa II-Tropinona ‡". Bioquímica . 42 (19): 5566–73. doi : 10.1021 / bi0272712 . PMID 12741812 .
- ^ Miller, MT; Bachmann, BO; Townsend, CA; Rosenzweig, AC (2002). "El ciclo catalítico de la β-lactámico sintetasa observado por instantáneas cristalográficas de rayos X" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 99 (23): 14752–7. Código Bibliográfico : 2002PNAS ... 9914752M . doi : 10.1073 / pnas.232361199 . PMC 137491 . PMID 12409610 .
- ^ Fiedler, E .; Thorell, S; Sandalova, T; Golbik, R; König, S; Schneider, G (2002). "Instantánea de un intermedio clave en la catálisis enzimática de tiamina: estructura cristalina del α-carbanión de (α, β-dihidroxietil) -tiamina difosfato en el sitio activo de la transcetolasa de Saccharomyces cerevisiae" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 99 (2): 591–5. Código Bibliográfico : 2002PNAS ... 99..591F . doi : 10.1073 / pnas.022510999 . PMC 117350 . PMID 11773632 .
