Cromatografía líquida de alta resolución
La cromatografía líquida de alta resolución ( HPLC ), anteriormente denominada cromatografía líquida de alta presión , es una técnica de química analítica utilizada para separar, identificar y cuantificar cada componente de una mezcla. Se basa en bombas para pasar un solvente líquido presurizado que contiene la mezcla de muestra a través de una columna llena con un material adsorbente sólido . Cada componente de la muestra interactúa de forma ligeramente diferente con el material adsorbente, lo que genera diferentes velocidades de flujo para los diferentes componentes y conduce a la separación de los componentes a medida que salen de la columna.
La HPLC se ha utilizado para la fabricación ( p. ej ., durante el proceso de producción de productos farmacéuticos y biológicos), legal ( p. ej ., detección de fármacos para mejorar el rendimiento en la orina), investigación ( p. ej ., separación de los componentes de una muestra biológica compleja o de productos químicos sintéticos similares ). entre sí) y médicos ( p. ej ., detección de niveles de vitamina D en suero sanguíneo). [1]
La cromatografía se puede describir como un proceso de transferencia de masa que implica adsorción . HPLC se basa en bombas para pasar un líquido presurizado y una mezcla de muestra a través de una columna llena de adsorbente, lo que lleva a la separación de los componentes de la muestra. El componente activo de la columna, el adsorbente, suele ser un material granular hecho de partículas sólidas ( p. ej ., sílice , polímeros, etc.), de 2 a 50 μm de tamaño. Los componentes de la mezcla de muestra se separan entre sí debido a sus diferentes grados de interacción con las partículas adsorbentes. El líquido presurizado suele ser una mezcla de disolventes ( por ejemplo ,, agua, acetonitrilo y/o metanol) y se denomina "fase móvil". Su composición y temperatura juegan un papel importante en el proceso de separación al influir en las interacciones que tienen lugar entre los componentes de la muestra y el adsorbente. Estas interacciones son de naturaleza física, como hidrofóbicas (dispersivas), dipolo-dipolo e iónicas, la mayoría de las veces una combinación.
La HPLC se distingue de la cromatografía líquida tradicional ("baja presión") porque las presiones operativas son significativamente más altas (50 a 350 bar), mientras que la cromatografía líquida ordinaria generalmente se basa en la fuerza de la gravedad para pasar la fase móvil a través de la columna. Debido a la pequeña cantidad de muestra separada en la HPLC analítica, las dimensiones típicas de la columna son de 2,1 a 4,6 mm de diámetro y de 30 a 250 mm de longitud. Además, las columnas de HPLC están hechas con partículas adsorbentes más pequeñas (de 2 a 50 μm de tamaño de partícula promedio). Esto le da a HPLC un poder de resolución superior (la capacidad de distinguir entre compuestos) al separar mezclas, lo que la convierte en una técnica cromatográfica popular.
El esquema de un instrumento de HPLC normalmente incluye un desgasificador, un muestreador, bombas y un detector. El muestreador lleva la mezcla de muestra a la corriente de fase móvil que la lleva a la columna. Las bombas entregan el flujo y la composición deseados de la fase móvil a través de la columna. El detector genera una señal proporcional a la cantidad de componente de la muestra que emerge de la columna, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes de la muestra. Un microprocesador digital y un software de usuario controlan el instrumento de HPLC y proporcionan análisis de datos. Algunos modelos de bombas mecánicas en un instrumento de HPLC pueden mezclar varios disolventes en proporciones que cambian con el tiempo, generando un gradiente de composiciónen la fase móvil. Varios detectores son de uso común, como UV/Vis , matriz de fotodiodos (PDA) o basados en espectrometría de masas . La mayoría de los instrumentos de HPLC también tienen un horno de columna que permite ajustar la temperatura a la que se realiza la separación.
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