La cromatografía de interacción hidrófila (o cromatografía líquida de interacción hidrófila , HILIC ) es una variante de la cromatografía líquida de fase normal que se superpone parcialmente con otras aplicaciones cromatográficas como la cromatografía iónica y la cromatografía líquida de fase inversa . HILIC utiliza fases estacionarias hidrófilas con eluyentes de tipo fase reversa . El nombre fue sugerido por el Dr. Andrew Alpert en su artículo de 1990 sobre el tema. [1] Describió el mecanismo cromatográfico como cromatografía de partición líquido-líquido.donde los analitos eluyen en orden de polaridad creciente, una conclusión respaldada por una revisión y reevaluación de los datos publicados. [2]
Superficie
Se puede utilizar cualquier superficie cromatográfica polar para las separaciones HILIC. Incluso se han utilizado sílices con enlaces no polares con una composición de disolvente orgánico extremadamente alta, cuando la sílice utilizada para los medios cromatográficos era particularmente polar. Con esa excepción, las fases HILIC se pueden agrupar en cinco categorías de superficies iónicas o polares neutrales:
- Sílice simple sin unir silanol o fases unidas por diol
- fases unidas amino o aniónicas
- fases unidas por amida
- fases unidas catiónicas
- fases unidas de ion híbrido [3]
Fase móvil
Una fase móvil típica para la cromatografía HILIC incluye acetonitrilo ("MeCN", también designado como "ACN") con una pequeña cantidad de agua. Sin embargo, se puede utilizar cualquier disolvente aprótico miscible con agua (por ejemplo, THF o dioxano ). También se pueden usar alcoholes, sin embargo, su concentración debe ser mayor para lograr el mismo grado de retención de un analito en relación con una combinación aprótica de disolvente y agua. Véase también Cromatografía en fase normal acuosa.
Se cree comúnmente que en HILIC, la fase móvil forma una capa rica en agua en la superficie de la fase estacionaria polar frente a la fase móvil deficiente en agua , creando un sistema de extracción líquido / líquido. El analito se distribuye entre estas dos capas. Sin embargo, HILIC es más que una simple partición e incluye interacciones de donantes de hidrógeno entre especies polares neutras, así como mecanismos electrostáticos débiles bajo las condiciones de alto contenido de solventes orgánicos utilizados para la retención. Esto distingue a HILIC como un mecanismo distinto de la cromatografía de intercambio iónico . Los compuestos más polares tendrán una interacción más fuerte con la capa acuosa estacionaria que los compuestos menos polares . Por tanto, se produce una separación basada en la polaridad y el grado de solvatación de un compuesto.
Aditivos
Los aditivos iónicos , como el acetato de amonio y el formiato de amonio, se utilizan generalmente para controlar el pH de la fase móvil y la fuerza iónica. En HILIC también pueden contribuir a la polaridad del analito, dando como resultado cambios diferenciales en la retención. Para analitos extremadamente polares (por ejemplo, antibióticos aminoglucósidos ( gentamicina ) o trifosfato de adenosina ), se requieren concentraciones más altas de tampón (aproximadamente 100 mM) para asegurar que el analito estará en una única forma iónica. De lo contrario, se observará una forma de pico asimétrica, colas cromatográficas y / o una mala recuperación de la fase estacionaria. Para la separación de analitos polares neutros (por ejemplo, carbohidratos), no se necesita tampón.
El uso de otras sales, como el perclorato de sodio 100-300 mM, que son solubles en mezclas de disolventes con alto contenido orgánico (aproximadamente 70% -90% de acetonitrilo ), puede usarse para aumentar la polaridad de la fase móvil para afectar la elución. Estas sales no son volátiles, por lo que esta técnica es menos útil con un espectrómetro de masas como detector. Por lo general, un gradiente (a cantidades crecientes de agua) es suficiente para promover la elución.
Todos los iones se dividen en la fase estacionaria hasta cierto punto, por lo que se requiere un "lavado" ocasional con agua para asegurar una fase estacionaria reproducible.
Aplicaciones
El modo de separación HILIC se utiliza ampliamente para la separación de algunas biomoléculas , moléculas orgánicas e inorgánicas [4] por diferencias de polaridad. Su utilidad ha aumentado debido a la preparación simplificada de muestras para muestras biológicas, cuando se analizan metabolitos, ya que el proceso metabólico generalmente da como resultado la adición de grupos polares para mejorar la eliminación del tejido celular. Esta técnica de separación también es particularmente adecuada para el análisis de glicosilación [5] y el aseguramiento de la calidad de glicoproteínas y glicoformas en productos médicos biológicos . [6] Para la detección de compuestos polares con el uso de espectrometría de masas de ionización por electropulverización como detector cromatográfico, HILIC puede ofrecer una sensibilidad diez veces mayor que la cromatografía de fase inversa [4] porque el disolvente orgánico es mucho más volátil.
Elección de pH
Con químicas de superficie que son débilmente iónicas, la elección del pH puede afectar la naturaleza iónica de la química de la columna. Si se ajusta correctamente, el pH se puede establecer para reducir la selectividad hacia grupos funcionales con la misma carga que la columna, o mejorarla para grupos funcionales con carga opuesta. De manera similar, la elección del pH afecta la polaridad de los solutos. Sin embargo, para las químicas de la superficie de la columna que son fuertemente iónicas y, por lo tanto, resistentes a valores de pH en el rango medio de la escala de pH (pH 3,5-8,5), estas separaciones reflejarán la polaridad de los analitos por sí solos y, por lo tanto, podrían ser más fácil de entender cuando se hace el desarrollo de métodos.
ERLIC
En 2008, Alpert acuñó el término ERLIC [7] (cromatografía de interacción hidrófila de repulsión electrostática) para las separaciones HILIC en las que se utiliza una química de superficie de columna iónica para repeler un grupo polar iónico común en un analito o dentro de un conjunto de analitos, para facilitar separación por los grupos polares restantes. Los efectos electrostáticos tienen un potencial químico de un orden de magnitud más fuerte que los efectos polares neutros. Esto permite minimizar la influencia de un grupo iónico común dentro de un conjunto de moléculas de analito; o para reducir el grado de retención de estos grupos funcionales más polares, incluso permitiendo separaciones isocráticas en lugar de un gradiente en algunas situaciones. Su publicación posterior describió además los efectos de orientación [8] que otros también han llamado fase normal de pares iónicos [9] o e-HILIC, reflejando mecanismos de retención sensibles a una porción iónica particular del analito, ya sea atractiva o repulsiva. Las separaciones ERLIC (eHILIC) no necesitan ser isocráticas, pero el efecto neto es la reducción de la atracción de un grupo polar particularmente fuerte, que luego requiere condiciones de elución menos fuertes, y la interacción mejorada del resto polar (iónico de carga opuesta, o no). -iónicos) grupos funcionales del analito (s).
EHILIC catiónico
Por ejemplo, se podría usar una química de superficie de intercambio catiónico (con carga negativa) para las separaciones de ERLIC para reducir la influencia sobre la retención de grupos aniónicos (con carga negativa) (los fosfatos de nucleótidos o de mezclas de antibióticos de fosfonilo; o grupos de ácido siálico de carbohidratos modificados). para permitir ahora la separación basada más en los grupos funcionales básicos y / o neutros de estas moléculas. La modificación de la polaridad de un grupo débilmente iónico (por ejemplo, carboxilo) en la superficie se logra fácilmente ajustando el pH para que esté dentro de dos unidades de pH del pKa de ese grupo. Para los grupos funcionales fuertemente iónicos de la superficie (es decir, sulfatos o fosfatos), se podría usar una cantidad menor de tampón para que la carga residual no esté completamente emparejada de iones. Un ejemplo de esto sería el uso de un 12,5 mM (en lugar de la recomendada> tampón 20 mM), pH 9,2 fase móvil en un polimérica , de ion híbrido , betaína - sulfonato superficie a fosfonilo separar mezclas de antibióticos (cada uno contiene un grupo fosfato). Esto aumenta la influencia de los grupos funcionales de ácido sulfónico de la columna de su química de superficie sobre su amina cuaternaria, ligeramente disminuida (por pH). En consonancia con esto, estos analitos mostrarán una retención reducida en la columna eluyendo antes, y en mayores cantidades de disolvente orgánico, que si se utilizara una superficie HILIC polar neutra. Esto también aumenta su sensibilidad de detección por espectrometría de masas de iones negativos.
EHILIC aniónico
Por analogía con lo anterior, se puede usar una química de la superficie de la columna de intercambio aniónico (cargada positivamente) para reducir la influencia sobre la retención de grupos funcionales catiónicos (cargados positivamente) para un conjunto de analitos, como cuando se aíslan selectivamente péptidos fosforilados o moléculas de polisacáridos sulfatados. . El uso de un pH entre 1 y 2 unidades de pH reducirá la polaridad de dos de los tres oxígenos ionizables del grupo fosfato y, por lo tanto, permitirá una fácil desorción de la química de la superficie (con carga opuesta). También reducirá la influencia de los carboxilos cargados negativamente en los analitos, ya que estarán protonados a este valor de pH bajo y, por lo tanto, contribuirán con una menor polaridad general a la molécula. Cualquier grupo amino común cargado positivamente será repelido de la química de la superficie de la columna y, por lo tanto, estas condiciones mejoran el papel de la polaridad del fosfato (así como de otros grupos polares neutros) en la separación.
Referencias
- ^ Alpert, Andrew J. (1990). "Cromatografía de interacción hidrófila para la separación de péptidos, ácidos nucleicos y otros compuestos polares". Revista de cromatografía . 499 : 177-196. doi : 10.1016 / S0021-9673 (00) 96972-3 . PMID 2324207 .
- ^ Petrus Hemström y Knut Irgum (2006). "Revisión: cromatografía de interacción hidrófila". J. Sep. Sci . 29 (12): 1784–1821. doi : 10.1002 / jssc.200600199 . PMID 16970185 .
- ^ Boguslaw Buszewski y Sylwia Noga (2012). "Cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC): una poderosa técnica de separación" . Anal. Bioanal. Chem . 402 (1): 231–247. doi : 10.1007 / s00216-011-5308-5 . PMC 3249561 . PMID 21879300 .
- ^ a b Eric S. Grumbach; et al. (Octubre de 2004). "Cromatografía de interacción hidrófila usando columnas de sílice para la retención de analitos polares y sensibilidad mejorada de ESI-MS" . Revista LCGC . Archivado desde el original el 6 de agosto de 2007 . Consultado el 14 de julio de 2008 .
- ^ Ahn, Joomi; Bones, Jonathan; Yu, Ying Qing; Rudd, Pauline M .; Gilar, Martín (1 de febrero de 2010). "Separación de glicanos marcados con 2-aminobenzamida mediante columnas de cromatografía de interacción hidrófila empaquetadas con sorbente de 1,7 μm". Journal of Chromatography B . 878 (3–4): 403–408. doi : 10.1016 / j.jchromb.2009.12.013 . PMID 20036624 .
- ^ Análisis de glicosilación por cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) - Mapeo de N-Glyco del dominio ZP del TGFR-3 murino (Nota de aplicación TOSOH Biosciences). Consultado el 23 de mayo de 2013.
- ^ Alpert, Andrew J. (enero de 2008). "Cromatografía de interacción hidrófila de repulsión electrostática para separación isocrática de solutos cargados y aislamiento selectivo de fosfopéptidos" . Anal. Chem . 80 (1): 62–76. doi : 10.1021 / ac070997p . PMID 18027909 .
- ^ Alpert, Andrew J .; et al. (Junio de 2010). "La orientación de péptidos afecta la selectividad en cromatografía de intercambio iónico" . Anal. Chem . 82 (12): 5253–5259. doi : 10.1021 / ac100651k . PMC 2884984 . PMID 20481592 .
- ^ Ding, W .; et al. (Septiembre de 2009). "Identificación y cuantificación de glicoproteínas mediante LC y MS de fase normal de emparejamiento de iones" . Proteómica molecular y celular . 8 (9): 2170–2185. doi : 10.1074 / mcp.M900088-MCP200 . PMC 2742440 . PMID 19525481 .