La normalización de los datos de la transferencia Western es un paso analítico que se realiza para comparar la abundancia relativa de una proteína específica en los carriles de una transferencia o gel bajo diversos tratamientos experimentales, o entre tejidos o etapas de desarrollo. [1] [2] El objetivo general de la normalización es minimizar los efectos que surgen de las variaciones en los errores experimentales, como la preparación inconsistente de la muestra, la carga desigual de la muestra en los carriles de gel o la transferencia desigual de proteínas, que pueden comprometer las conclusiones que se pueden obtener de Datos de Western blot . [1] Actualmente, existen dos métodos para normalizar el Western blotdatos: (i) normalización de proteínas de mantenimiento y (ii) normalización de proteínas totales. [1] [2] [3] [4]
Procedimiento
La normalización se produce directamente en el gel o en la membrana de transferencia. Primero, se toman imágenes del gel o mancha teñidos, se dibuja un rectángulo alrededor de la proteína objetivo en cada carril y se mide la intensidad de la señal dentro del rectángulo. [1] La intensidad de la señal obtenida puede luego normalizarse con respecto a la intensidad de la señal del control interno de carga detectado en el mismo gel o transferencia. [1] Cuando se utilizan tinciones de proteínas, la membrana se puede incubar con la tinción elegida antes o después de la inmunodetección, según el tipo de tinción. [5]
Controles de proteína de limpieza
Los genes y las proteínas de mantenimiento , que incluyen β-actina , GAPDH , HPRT1 y RPLP1 , se utilizan a menudo como controles internos en las transferencias de Western porque se cree que se expresan de forma constitutiva, en los mismos niveles, en todos los experimentos. [1] [2] [6] [7] Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la expresión de proteínas de mantenimiento (HKP) puede cambiar en diferentes tipos de células y condiciones biológicas. [1] [8] [9] [10] Por lo tanto, los editores científicos y las agencias de financiamiento ahora requieren que los controles de normalización sean previamente validados para cada experimento para asegurar la reproducibilidad y precisión de los resultados. [8] [9] [10]
Anticuerpos fluorescentes
Cuando se utilizan anticuerpos fluorescentes para imágenes de proteínas en transferencias Western, la normalización requiere que el usuario defina los límites superior e inferior de cuantificación y caracterice la relación lineal entre la intensidad de la señal y el volumen de masa de la muestra para cada antígeno. [1] Tanto la proteína diana como el control de normalización deben emitir fluorescencia dentro del rango dinámico de detección. [1] Muchos HKP se expresan en niveles altos y se prefieren para su uso con proteínas diana altamente expresadas. [1] Las proteínas de menor expresión son difíciles de detectar en la misma transferencia. [1]
Los anticuerpos fluorescentes están disponibles comercialmente y se recomiendan anticuerpos completamente caracterizados para garantizar la coherencia de los resultados. [11] [12] [13]
Cuando no se utiliza la detección fluorescente, la proteína de control de carga y la proteína de interés deben diferir considerablemente en peso molecular para que estén adecuadamente separadas por electroforesis en gel para un análisis preciso. [1]
Decapado de membranas
Las membranas deben eliminarse y volverse a sondar utilizando un nuevo conjunto de anticuerpos de detección cuando se detectan múltiples objetivos proteicos en la misma transferencia. [6] La eliminación ineficaz podría resultar en una señal débil de la proteína objetivo. [6] Para evitar la pérdida del antígeno, solo se recomiendan tres incubaciones de extracción por membrana. [6] Podría ser difícil eliminar completamente la señal de proteínas muy abundantes, por lo que se recomienda que se detecten primero las proteínas de baja expresión. [6]
Controles de aumento exógeno
Dado que los niveles de HKP pueden ser inconsistentes entre tejidos, los científicos pueden controlar la proteína de interés agregando una proteína pura exógena de una concentración conocida dentro del rango lineal del anticuerpo. [8] [9] [10] En comparación con HKP, se encuentra disponible una variedad más amplia de proteínas para controles de aumento. [14]
Normalización de proteínas totales
En la normalización de proteínas totales (TPN), la abundancia de la proteína diana se normaliza a la cantidad total de proteína en cada carril. [3] [4] Debido a que la TPN no depende de un único control de carga, no es necesario validar los controles y eliminar / reprobar las manchas para la detección de HKP. [6] [15] Esto puede mejorar la precisión (hasta 0,1 µg de proteína total por carril), la rentabilidad y la fiabilidad de los datos. [dieciséis]
Las manchas fluorescentes y los geles sin manchas requieren un equipo especial para visualizar las proteínas en el gel / blot. [5] Es posible que las manchas no cubran la mancha de manera uniforme; podría acumularse más mancha en los bordes de la mancha que en el centro. La falta de uniformidad en la imagen puede resultar en una normalización inexacta. [1]
Tinciones de preanticuerpos
Los tintes aniónicos como Ponceau S y Coomassie Brilliant Blue , y los tintes fluorescentes como Sypro Ruby y Deep Purple, se utilizan antes de agregar los anticuerpos porque no afectan la inmunodetección aguas abajo. [17] [18] [19] [20]
Ponceau S es un tinte reversible con carga negativa que tiñe las proteínas de un color rosa rojizo y se elimina fácilmente lavándolo con agua. [21] [22] La intensidad de la tinción de Ponceau S disminuye rápidamente con el tiempo, por lo que la documentación debe realizarse rápidamente. [5] Se informa un rango lineal de hasta 140 µg para Ponceau S con poca reproducibilidad debido a su intensidad de tinción altamente dependiente del tiempo y baja relación señal-ruido. [21] [22]
Los tintes fluorescentes como Sypro Ruby tienen un amplio rango lineal y son más sensibles que los tintes aniónicos. [22] Son tinciones fotoestables permanentes que se pueden visualizar con un transiluminador de luz azul o UV estándar o con un escaneo láser. [1] [22] Las membranas se pueden documentar en película o digitalmente usando una cámara CCD . [23] La tinción Sypro Ruby blot requiere mucho tiempo y tiende a saturar por encima de 50 μg de proteína por carril. [22]
Tinciones post-anticuerpos
El negro amido es una tinción aniónica post-anticuerpo permanente de uso común que es más sensible que Ponceau S. [24] Esta tinción se aplica después de la inmunodetección. [24]
Tecnología sin manchas
La tecnología sin manchas emplea una química en gel para la obtención de imágenes. [22] [25] [26] Esta reacción química no afecta la transferencia de proteínas ni la unión de anticuerpos aguas abajo. [27] Además, no implica pasos de tinción / decoloración, y la intensidad de las bandas permanece constante a lo largo del tiempo. [28]
La tecnología sin manchas no puede detectar proteínas que no contienen residuos de triptófano . Se necesita un mínimo de dos triptófanos para permitir la detección. [5] El rango lineal para la normalización sin manchas es de hasta 80 µg de proteína por carril para 18 pocillos y hasta 100 µg por carril para geles de tamaño medio Criterion de 12 pocillos. Este rango es compatible con las cargas típicas de proteínas en las transferencias Western cuantitativas y permite cálculos de control de carga en un amplio rango de carga de proteínas. [29] [4] Recientemente también se encuentra disponible un método sin manchas más eficiente. [30] [31] Cuando se utilizan altas cargas de proteínas, la tecnología sin manchas ha demostrado tener más éxito que las manchas. [29]
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enlaces externos
- Flujo de trabajo sin manchas V3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en Western Blot