Quimera de dedos de zinc
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Las quimeras de proteína de dedo de zinc son proteínas quiméricas compuestas por un dominio de proteína de dedo de zinc que se une al ADN y otro dominio a través del cual la proteína ejerce su efecto. El dominio efector puede ser un activador transcripcional (A) o represor (R), [1] un dominio de metilación (M) o una nucleasa (N). [2]

La modificación del dominio de dedo de zinc de unión al ADN endógeno es la base del campo más avanzado en la construcción de factores de transcripción artificiales específicos de genes . [1] La vinculación de seis ZFP produce un sitio objetivo de 18-19 pb. Suponiendo especificidad para esa secuencia y que la secuencia del genoma es aleatoria, 18 pb es lo suficientemente larga como para ser única en todos los genomas conocidos [3] [4] De hecho, el espaciamiento entre subsitios se convierte en parte de la secuencia objetivo debido a restricciones en la flexibilidad de la proteína que se puede controlar. [1] Dirigirse a sitios tan pequeños como 9 pb proporciona cierto grado de especificidad, casi con certeza atribuible en parte a la oclusión de la cromatina. [4]

Producción de dominio de proteína con dedos de zinc

Dependiendo de los requisitos de la investigación, existen varias técnicas disponibles para definir un dominio de reconocimiento de ADN que conferirá la especificidad de un factor de transcripción basado en ZFP. Se han descrito tres estrategias de presentación de fagos , que implican una selección paralela, secuencial o bipartita de los dedos de zinc constituyentes.

Selección paralela

El enfoque de selección paralela (Fig. 1 (A)) asume que los dominios de dedos de zinc individuales son funcionalmente independientes. Sobre esta base, los dominios predeterminados existentes deben ser utilizables sin diseño o selección adicionales, lo que la convierte en una técnica rápida y accesible para cualquier laboratorio. [5] [6] Esto no es cierto en todos los casos, por lo que esta estrategia es susceptible de sufrir problemas relacionados con la superposición del sitio objetivo en una serie de secuencias objetivo, como se analiza más adelante. Si es necesario, puede ser posible superar el problema del solapamiento del sitio objetivo aleatorizando los residuos de aminoácidos en la interfaz de dos dedos de zinc en los que ocurre. [5]

Selección secuencial

La selección secuencial (Fig. 1 (B)), presentada por el grupo Pabo en 1997, abarca la unión cooperativa entre dedos de zinc para producir dominios de unión al ADN de gran afinidad y especificidad. [7]Como sugiere el nombre, cada dedo se selecciona de una biblioteca aleatoria en el contexto del dedo seleccionado previamente. Las técnicas utilizadas en la selección son similares a las descritas a continuación, excepto que el oligonucleótido diana utilizado en la selección contiene la secuencia diana completa. Como se muestra en la Fig. 1, se crea una biblioteca en la que el dedo tres contiene la hélice alfa aleatoria. Se selecciona el dominio con las mejores características de unión y luego se incluye en otra biblioteca en la que se quita el ancla dedo-uno y se agrega otro dedo aleatorizado al extremo opuesto. Esto continúa y da como resultado un dominio de unión al ADN en el que todos los dedos se seleccionaron en el contexto del dedo vecino y dado que cada ronda de selección se aplica a la misma secuencia objetivo final,La superposición del sitio de destino todavía se produce, pero es una ventaja más que un obstáculo.

El principal inconveniente de este enfoque es la necesidad de producir una biblioteca separada para cada dedo de zinc, lo que excede la capacidad de la mayoría de los laboratorios.

Selección bipartita

El método de selección bipartita (Fig. 1 (C)) fue propuesto por Isalan et al., 2001 [8] como un compromiso entre las estrategias de selección paralela y secuencial. Los primeros y últimos 5 pb del sitio objetivo de 9 pb se seleccionan en paralelo y se combinan para producir una biblioteca de la que se elige la ZFP final.

Para mantener el tamaño de la biblioteca dentro de límites razonables, esta técnica se limita a la aleatorización de solo los residuos clave implicados en el reconocimiento de bases. Además, a diferencia de la selección en paralelo, esta técnica requiere múltiples panorámicas antes de que se pueda construir una nueva ZFP. [6]

Selección de dedos de zinc mediante visualización de fagos

Con el fin de determinar la secuencia de aminoácidos más apropiada en la hélice alfa de un dedo de zinc para unirse a una secuencia de ADN dada, se puede emplear una técnica que implique la presentación de fagos. Al alterar el genoma del bacteriófago seleccionado, es posible crear un fago que mostrará una ZFP como parte de su cubierta proteica. Posteriormente, se puede probar la adherencia de dicho fago, a través de los dedos de zinc unidos, a un oligonucleótido que contiene la secuencia de interés, mientras que otros fagos no adherentes se eliminan por lavado. El ADN dentro del fago codifica las ZFP expresadas, por lo que la extracción y secuenciación del ADN del fago unido proporciona información sobre las configuraciones de aminoácidos adecuadas para unirse a una secuencia específica. Esto constituye la base de la investigación de la unión de ZFP mediante presentación de fagos. [9] [10]

El trabajo se realiza típicamente utilizando la ZFP-TF Zif268 murina o uno de sus derivados, como base de las modificaciones de la secuencia de dedos de zinc, ya que es la mejor caracterizada de todas las proteínas de dedos de zinc. [3] [10] Sus derivados C7 o C7.GAT , se utilizan a menudo por su afinidad y especificidad de unión superiores. C7.GAT se ha utilizado para investigar las familias de secuencias 5'-ANN-3 'y 5'-CNN-3' ya que el tercer dedo de C7 define una guanina o timina en la posición 5 'de la secuencia de dos dedos (objetivo superposición de sitios). [4] [10] [11] Fago auxiliar filamentoso y el ADN del fago lambda se utiliza en la presentación del fago. Debido a las limitaciones en el tamaño de las bibliotecas que pueden construirse rutinariamente, la asignación al azar puede estar limitada a las mayoría de los aminoácidos influyentes en la secuencia ZFP como se infiere por cristalografía de rayos X . Las posiciones se identificaron como posiciones de hélice -1, 2, 3, 4, 5 y 6 en los dedos uno y tres, y posiciones -2, -1, 1, 2, 3 y 4 en el dedo dos en un estudio publicado por Wu et al. Alabama. (1995), [10] sin embargo, otro estudio de Segal et al. (1999) [3] sugiere la importancia de todas las posiciones de -2 a 6 debido a la afinidad inespecífica de algunos aminoácidos y la capacidad de otros para estabilizar interacciones adyacentes.

Selección in vitro de dedos de zinc

Se utiliza como objetivo un ADN en horquilla corto (~ 34 nt) que contiene el sitio de unión de ZFP con alteraciones que ocurren en un solo subsitio. El oligonucleótido utilizado puede sintetizarse para incluir un grupo amino n-hexil primario en su extremo 5 ', que luego se utiliza para unir albúmina de suero bovino (BSA). En este caso, el conjugado se usa para recubrir previamente un pocillo de microtitulación, antes de aplicar ~ 10 13 unidades de fago formadoras de colonias. Después de la incubación, se eliminan los fagos y se lava la placa con tampón que contiene Tween 20 al 0,5% para eliminar los fagos no adherentes. [10] Usando un tampón de elución ácido, los fagos adherentes se eliminan y se neutralizan con base Tris . [9]Se completan rondas adicionales de cribado para asegurar el enriquecimiento de la muestra, infectando las células bacterianas con el fago eluido y el fago auxiliar y luego recolectando el fago [que muestra ZFP] producido para la siguiente ronda de cribado. Como alternativa a la BSA, el ADN diana de la horquilla puede ser biotinilado y después extraído por medio de estreptavidina recubiertas con perlas magnéticas de estreptavidina (forma enlaces muy fuertes con biotina). [3]

Para aumentar la especificidad del fago seleccionado, especialmente cuando se están investigando bibliotecas más grandes, se utilizan oligonucleótidos competidores para secuestrar aquellas proteínas con dedos de zinc de menor especificidad antes de añadir el oligonucleótido diana biotinilado. El ADN del esperma de arenque cortado, por ejemplo, se unirá al fago con una adherencia no específica al ADN. Las rondas posteriores de cribado implican concentraciones crecientes de oligonucleótidos no diana sintetizados específicamente donde todo excepto la secuencia del subsitio diana permanece igual, hasta una única diferencia de nucleótido. En particular, la secuencia diana de la ZFP original que se sometió a mutagénesis se usa en gran cantidad para seleccionar contra "fagos parentales" que contaminan la biblioteca.La unión de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina puede bloquearse mediante blotto y fagos que muestran anticuerpos (irrelevantes), de modo que la unión solo se produce a moléculas con una afinidad tan alta como la biotina. Los fagos no específicos se eliminan como antes, utilizando un tampón que incluye Tween 20 diluido. Los fagos unidos se recogen en virtud de las perlas magnéticas y pueden eluirse mediante incubación contripsina . Por tanto, sólo se seleccionarán aquellos fagos que muestren ZFP muy específicas. [3] [11]

Después de la elución, el fago se puede sembrar y extraer el ADN de las unidades formadoras de placas individuales, restringir y extraer los fragmentos de tamaño apropiado después de la separación por PAGE. Luego, el ADN puede secuenciarse para descubrir la estructura primaria de la proteína que produce adherencia a la secuencia diana. Este proceso se repite para cada uno de los subsitios de un solo dedo 5'-NNN-3 'que se están investigando.

Arreglos de dedos de zinc diseñados

La generación de matrices de dedos de zinc Cys 2 His 2 diseñados es el método más desarrollado para crear proteínas capaces de apuntar a las secuencias de ADN genómico deseadas. La mayoría de las matrices de dedos de zinc diseñadas se basan en el dominio de dedos de zinc del factor de transcripción murino Zif268, aunque algunos grupos han utilizado matrices de dedos de zinc basadas en el factor de transcripción humano SP1. Zif268 tiene tres motivos de dedos de zinc individuales que se unen colectivamente a una secuencia de 9 pb con alta afinidad. [12] La estructura de esta proteína unida al ADN se resolvió en 1991 [13] y estimuló una gran cantidad de investigación sobre arreglos de dedos de zinc diseñados. En 1994 y 1995, varios grupos utilizaron la presentación de fagospara alterar la especificidad de un solo dedo de zinc de Zif268. [14] [15] [16] [17] Carlos F. Barbas y col. también informó sobre el desarrollo de la tecnología de dedos de zinc en la literatura de patentes y se le han otorgado varias patentes que han sido importantes para el desarrollo comercial de la tecnología de dedos de zinc. [18] [19] Los arreglos típicos de dedos de zinc diseñados tienen entre 3 y 6 motivos de dedos de zinc individuales y se unen a sitios objetivo que van desde 9 pares de bases hasta 18 pares de bases de longitud. Las matrices con 6 motivos de dedos de zinc son particularmente atractivas porque se unen a un sitio objetivo que es lo suficientemente largo como para tener una buena posibilidad de ser único en el genoma de un mamífero. [20]Hay dos métodos principales que se utilizan actualmente para generar matrices de dedos de zinc diseñados, ensamblaje modular y un sistema de selección de bacterias, y existe cierto debate sobre qué método es el más adecuado para la mayoría de las aplicaciones. [21] [22]

Montaje modular

El método más sencillo para generar nuevas matrices de dedos de zinc es combinar "módulos" de dedos de zinc más pequeños de especificidad conocida. La estructura de la proteína con dedos de zinc Zif268 unida al ADN descrita por Pavletich y Pabo en su publicación de 1991 ha sido clave para gran parte de este trabajo y describe el concepto de obtener dedos para cada uno de los 64 posibles tripletes de pares de bases y luego mezclarlos y emparejarlos. dedos para diseñar proteínas con cualquier especificidad de secuencia deseada. [13] El proceso de ensamblaje modular más común implica combinar dedos de zinc separados que pueden reconocer cada uno una secuencia de ADN de 3 pares de bases para generar matrices de 3, 4, 5 o 6 dedos que reconocen los sitios objetivo que van desde 9 pares de bases hasta 18 pares de bases de longitud. . Otro método utiliza módulos de 2 dedos para generar matrices de dedos de zinc con hasta seis dedos de zinc individuales. [23] El Laboratorio Barbas del Instituto de Investigación Scripps utilizó la presentación de fagos para desarrollar y caracterizar dominios de dedos de zinc que reconocen la mayoría de las secuencias de tripletes de ADN [24] [25] [26] mientras que otro grupo aisló y caracterizó dedos individuales del genoma humano. [27]Un posible inconveniente del ensamblaje modular en general es que las especificidades de los dedos de zinc individuales pueden superponerse y pueden depender del contexto de los dedos de zinc circundantes y del ADN. Un estudio reciente demostró que una alta proporción de matrices de dedos de zinc de 3 dedos generadas por ensamblaje modular no logran unir su objetivo previsto con suficiente afinidad en un ensayo bacteriano de dos híbridos y no funcionan como nucleasas de dedos de zinc , pero la tasa de éxito fue algo más alto cuando se apuntaron a sitios de la forma GNNGNNGNN. [28] Un estudio posterior utilizó ensamblaje modular para generar nucleasas de dedos de zinc tanto con matrices de 3 dedos como con matrices de 4 dedos y observó una tasa de éxito mucho mayor con las matrices de 4 dedos. [29] También se ha informado de una variante de ensamblaje modular que tiene en cuenta el contexto de los dedos vecinos y este método tiende a producir proteínas con un rendimiento mejorado en relación con el ensamblaje modular estándar. [30]

Métodos de selección

Se han utilizado numerosos métodos de selección para generar matrices de dedos de zinc capaces de dirigirse a las secuencias deseadas. Los esfuerzos de selección iniciales utilizaron la presentación de fagos para seleccionar proteínas que se unían a una diana de ADN determinada de un gran grupo de matrices de dedos de zinc parcialmente aleatorizadas. Esta técnica es difícil de usar en más de un dedo de zinc a la vez, por lo que se desarrolló un proceso de varios pasos que generaba una matriz de 3 dedos completamente optimizada al agregar y optimizar un solo dedo de zinc a la vez. [31] Esfuerzos más recientes han utilizado sistemas de un híbrido de levadura, sistemas bacterianos de un híbrido y dos híbridos y células de mamíferos. Un nuevo método prometedor para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc de 3 dedos utiliza un sistema bacteriano de dos híbridos y sus creadores lo han denominado "ABIERTO".[32] Este sistema combina grupos preseleccionados de dedos de zinc individuales que fueron seleccionados para unir un triplete dado y luego utiliza una segunda ronda de selección para obtener matrices de 3 dedos capaces de unir una secuencia deseada de 9 pb. Este sistema fue desarrollado por el Zinc Finger Consortium como una alternativa a las fuentes comerciales de arreglos de dedos de zinc diseñados. Es algo difícil comparar directamente las propiedades de unión de las proteínas generadas con este método con las proteínas generadas por ensamblaje modular, ya que nunca se han informado los perfiles de especificidad de las proteínas generadas por el método OPEN.

Aplicaciones

Las matrices de dedos de zinc diseñadas se pueden utilizar en numerosas aplicaciones, como factores de transcripción artificiales, metilasas de dedos de zinc, recombinasas de dedos de zinc y nucleasas de dedos de zinc . [33] Si bien los estudios iniciales con otro dominio de unión al ADN de los efectores TAL bacterianos son prometedores, [34] [35] [36] [37] queda por ver si estos dominios son adecuados para algunas o todas las aplicaciones en las que se diseñaron Actualmente se utilizan dedos de zinc. Los factores de transcripción artificiales con matrices de dedos de zinc diseñados se han utilizado en numerosos estudios científicos y un factor de transcripción artificial que activa la expresión de VEGF.Actualmente se está evaluando en humanos como un tratamiento potencial para varias indicaciones clínicas. Las nucleasas de dedos de zinc se han convertido en reactivos útiles para manipular genomas de muchos organismos superiores, incluidos Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , tabaco , maíz , [23] pez cebra , [38] varios tipos de células de mamíferos [39] y ratas . [40] Un ensayo clínico en curso está evaluando las nucleasas de dedos de zinc que alteran el gen CCR5 en las células T humanas CD4 + como un tratamiento potencial para el VIH / SIDA . [41]

Investigar las características vinculantes

Estas investigaciones requieren el uso de ZFP solubles, ya que la unión al fago puede alterar las características de unión de los dedos de zinc. [3] Una vez que se ha seleccionado una ZFP, su secuencia se subclona de pComb3H en un vector de expresión bacteriano modificado, pMal-c2 , uniéndolo a una secuencia que codifica la proteína de unión a maltosa . El recombinante luego se transforma en XL1-Bluecélulas y la expresión se induce mediante la adición de isopropil β-D-tiogalactósido (IPTG). A continuación, los extractos de congelación / descongelación se pueden purificar para su uso en los siguientes experimentos. Si bien la purificación no es necesaria para el ELISA de varios objetivos, es esencial para medir la afinidad de unión por resonancia de plasmón y huellas de ADNasa. Se puede realizar utilizando una columna FPLC de heparina-sefarosa equilibrada con tampón de zinc seguida de la confirmación de la homogeneidad mediante densitometría en gel SDS PAGE [4] Se utilizan las mismas técnicas para examinar las propiedades de unión de la quimera polidactil ZFP completa [42]

Prueba de especificidad

La especificidad de las ZFP seleccionadas mediante la presentación de fagos se prueba mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de objetivos múltiples . Las ZFP se aplican a pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina y un oligonucleótido diana biotinilado. Después de la incubación, los pocillos se lavan para eliminar zinc dedos si no son adherentes a la secuencia diana, seguido por la aplicación de anti-MBP (ratón proteína de unión a maltosa ) de anticuerpo y la incubación. Se agrega el anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado a la fosfatasa alcalina y se deja que se una, seguido de lavado para eliminar el anticuerpo, si no está unido a los dedos de zinc. Se agrega sustrato de fosfatasa alcalina y después de detener la reacción, la densidad ópticaa 405 nm (OD405) se determina mediante espectrofotometría [4]

La lectura del espectrofotómetro depende de la cantidad de fosfatasa alcalina presente en el pozo, que a su vez es proporcional a la unión de la ZFP en cuestión. Si la ZFP se une a una secuencia para la que no se seleccionó con demasiada afinidad, no es lo suficientemente específica para la mayoría de los propósitos médicos y lo más probable es que sea rechazada.

Estos ensayos se repiten utilizando diferentes oligonucleótidos diana. Cuando se investigan los dedos de zinc que se unen a las secuencias 5'-XNN-3 ', por ejemplo, será necesario investigar las 16 posibles secuencias de oligonucleótidos. Además, para probar la especificidad del nucleótido 5 ', el complemento completo de los cuatro 5'-ANN-3', 5'-CNN-3 ', 5'-GNN-3'. Las familias 5'-TNN-3 'se utilizan como dianas en cuatro reacciones separadas y se compara la unión relativa en cada una [4]

Análisis cinético

El análisis cinético proporciona información sobre la afinidad y la especificidad de la adherencia del dedo de zinc al objetivo. Puede realizarse utilizando equipo disponible comercialmente utilizando resonancia de plasmón de superficie . La superficie del chip sensor se recubre con estreptavidina purificada por afinidad antes de la aplicación de oligonucleótidos biotinilados que también se adhieren a la superficie. [10] La tasa de asociación (k on ) se calcula midiendo la tasa de unión de ZFP a la superficie usando varias concentraciones de proteína diferentes, mientras que la tasa de disociación (k off ) se puede calcular aumentando la tasa de flujo después de la asociación. Las matemáticas se realizan mediante el software proporcionado con el instrumento. [10]

Alternativamente, K d se puede calcular a partir de un ensayo de cambio de movilidad en gel en el que se incuba la misma proteína purificada con diluciones seriadas de purificado en gel, oligonucleótido diana marcada con 32P-end. Las reacciones de incubación se resuelven luego, durante un período corto, en un gel de poliacrilamida y se cuantifican usando un software y un generador de imágenes disponibles comercialmente. K d se calcula mediante análisis de Scatchard usando la ecuación de isoterma de unión; θ b = [péptido] / ([péptido] + K d ). [3] [43]

Análisis de huella de DNasa I

Artículo principal: análisis de huella de DNasa I

Para determinar el espacio ocupado por una ZFP cuando se une a su ADN diana, se amplifica un fragmento del gen diana mediante PCR y se mezcla con un fragmento promotor marcado en el extremo 32P. A continuación, esta reacción se incuba con varias concentraciones diferentes de ZFP producidas y purificadas utilizando uno de los métodos de sobreexpresión descritos anteriormente (p. Ej. PMal-c2 y XL1-Blue) y métodos de purificación. Digestión con DNasa Iproducirá fragmentos de diferentes longitudes, pero cuando se ha permitido que la ZFP se una a una alta concentración, las longitudes de los fragmentos correspondientes no estarán presentes en la mezcla, ya que la ZFP ha ocluido la actividad DNasa en estas ubicaciones. Las muestras se separan en un gel de acrilamida (~ 6%), urea (8 M), que se usa para exponer placas de imágenes de fósforo y se registran mediante una máquina de imágenes de fósforo disponible comercialmente. El análisis de software también se puede utilizar para producir valores de K d [4]

Superposición del sitio de destino

Artículo principal: superposición del sitio de destino

Ciertas secuencias de residuos de aminoácidos son capaces de reconocer y son específicas de un sitio objetivo extendido de cuatro o incluso cinco nucleótidos [44]. Cuando esto ocurre en una ZFP en la que los subsitios de tres nucleótidos son contiguos, un dedo de zinc interfiere con el sitio objetivo del dedo de zinc adyacente a él, una situación conocida como superposición del sitio objetivo.

Factores de transcripción de proteínas con dedos de zinc

Artículo principal: factor de transcripción de proteína de dedo de zinc

Las ZFP-TF, que consisten en activadores y represores, son factores de transcripción compuestos por un dominio de proteína con dedo de zinc y cualquiera de una variedad de dominios efectores de factores de transcripción que ejercen su efecto modulador alrededor de cualquier secuencia a la que se une el dominio ZFP.

Nucleasas de dedos de zinc

Artículo principal: nucleasa de dedos de zinc

Las nucleasas con dedos de zinc incluyen un dominio de nucleasas como FokI , capaz de introducir roturas de doble hebra en el locus de cualquier secuencia a la que se une el dominio de proteína con dedos de zinc.

Ver también

  • Terapia de genes
  • Nucleasa de dedos de zinc
  • Proteína de dedo de zinc
  • Factor de transcripción de proteína de dedo de zinc

Referencias

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