Una nucleasa (también conocida arcaicamente como nucleodepolimerasa o polinucleotidasa ) es una enzima capaz de escindir los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de ácidos nucleicos . Las nucleasas diversamente efectuar único y doble breaks varados en sus moléculas diana. En los organismos vivos, son maquinaria esencial para muchos aspectos de la reparación del ADN . Los defectos en ciertas nucleasas pueden causar inestabilidad genética o inmunodeficiencia . [1] Las nucleasas también se utilizan ampliamente enclonación molecular . [2]
Hay dos clasificaciones principales basadas en el lugar de actividad. Las exonucleasas digieren los ácidos nucleicos de los extremos. Las endonucleasas actúan en regiones en medio de moléculas diana. Además, se subcategorizan como desoxirribonucleasas y ribonucleasas . El primero actúa sobre el ADN , el segundo sobre el ARN . [2]
Historia
A finales de la década de 1960, los científicos Stuart Linn y Werner Arber aislaron ejemplos de los dos tipos de enzimas responsables de la restricción del crecimiento de fagos en la bacteria Escherichia coli ( E. coli ). [3] [4] Una de estas enzimas agregó un grupo metilo al ADN, generando ADN metilado , mientras que la otra escindió el ADN no metilado en una amplia variedad de ubicaciones a lo largo de la molécula. El primer tipo de enzima se llamó " metilasa " y el otro " nucleasa de restricción ". Estas herramientas enzimáticas eran importantes para los científicos que estaban reuniendo las herramientas necesarias para " cortar y pegar " moléculas de ADN. Lo que entonces se necesitaba era una herramienta que cortara el ADN en sitios específicos, en lugar de en sitios aleatorios a lo largo de la molécula, para que los científicos pudieran cortar las moléculas de ADN de una manera predecible y reproducible.
Se produjo un desarrollo importante cuando HO Smith, KW Wilcox y TJ Kelley, que trabajaban en la Universidad Johns Hopkins en 1968, aislaron y caracterizaron la primera nucleasa de restricción cuyo funcionamiento dependía de una secuencia de nucleótidos de ADN específica . Trabajando con la bacteria Haemophilus influenzae , este grupo aisló una enzima, llamada Hind II , que siempre corta las moléculas de ADN en un punto particular dentro de una secuencia específica de seis pares de bases. Descubrieron que la enzima Hind II siempre corta directamente en el centro de esta secuencia (entre el tercer y cuarto par de bases)
Sistema de clasificación numérica
La mayoría de las nucleasas están clasificadas por el número de la Comisión de Enzimas del "Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular " como hidrolasas (número CE 3). Las nucleasas pertenecen al igual que la fosfodiesterasa , la lipasa y la fosfatasa a las esterasas (número EC 3.1), un subgrupo de las hidrolasas. Las esterasas a las que pertenecen las nucleasas se clasifican con los números EC 3.1.11 - Número EC 3.1.31.
Estructura
La estructura primaria de la nucleasa está, en general, mal conservada y mínimamente conservada en los sitios activos, cuyas superficies comprenden principalmente residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Las nucleasas se pueden clasificar en familias de plegamiento. [5]
Reconocimiento del sitio
Una nucleasa debe asociarse con un ácido nucleico antes de que pueda escindir la molécula. Eso implica cierto grado de reconocimiento. Las nucleasas emplean diversas asociaciones tanto inespecíficas como específicas en sus modos de reconocimiento y unión. Ambos modos juegan un papel importante en los organismos vivos, especialmente en la reparación del ADN. [7]
Las endonucleasas inespecíficas involucradas en la reparación del ADN pueden escanear el ADN en busca de secuencias diana o daño . Tal nucleasa se difunde a lo largo del ADN hasta que encuentra un objetivo, sobre el cual los residuos de su sitio activo interactúan con los grupos químicos del ADN. En el caso de endonucleasas como EcoRV , BamHI y PvuII, esta unión inespecífica implica interacciones electrostáticas entre el área superficial mínima de la proteína y el ADN. Este débiles hojas de asociación la forma general de la DNA no deformada, que queda en forma B . [7]
En contraste, una nucleasa de sitio específico forma asociaciones mucho más fuertes. Atrae el ADN hacia el surco profundo de su dominio de unión al ADN . Esto da como resultado una deformación significativa de la estructura terciaria del ADN y se logra con superficies ricas en residuos básicos (cargados positivamente). Participa en una extensa interacción electrostática con el ADN. [7]
Algunas nucleasas involucradas en la reparación del ADN exhiben especificidad de secuencia parcial. sin embargo, la mayoría son inespecíficas, reconociendo en cambio anomalías estructurales producidas en la cadena principal del ADN por desajustes de pares de bases . [7]
Nucleasa de estructura específica
Para más detalles, consulte la endonucleasa de colgajo .
Nucleasa específica de secuencia
Enzima | Fuente | Secuencia de reconocimiento | Cortar |
---|---|---|---|
Hind II | Haemophilus influenzae | 5'– GTYRAC – 3 ' | 5'– GTY RAC –3 ' |
R = A o G ; Y = C o T |
Hay más de 900 enzimas de restricción, algunas de secuencia específica y otras no, que se han aislado de más de 230 cepas de bacterias desde el descubrimiento inicial de Hind II. Estas enzimas de restricción generalmente tienen nombres que reflejan su origen: la primera letra del nombre proviene del género y las dos segundas letras provienen de la especie de la célula procariota de la que se aislaron. Por ejemplo, Eco RI proviene de la bacteria Escherichia coli RY13, mientras que HindII proviene de la cepa Rd de Haemophilus influenzae . Los números que siguen a los nombres de las nucleasas indican el orden en el que se aislaron las enzimas de cepas individuales de bacterias: Eco RI , Eco RII .
Endonucleasas
Una endonucleasa de restricción funciona "escaneando" la longitud de una molécula de ADN. Una vez que encuentra su secuencia de reconocimiento específica particular, se unirá a la molécula de ADN y hará un corte en cada una de las dos cadenas principales de azúcar-fosfato. Las posiciones de estos dos cortes, tanto entre sí como con la secuencia de reconocimiento en sí, están determinadas por la identidad de la endonucleasa de restricción. Diferentes endonucleasas producen diferentes conjuntos de cortes, pero una endonucleasa siempre cortará una secuencia de bases en particular de la misma manera, sin importar en qué molécula de ADN esté actuando. Una vez que se han realizado los cortes, la molécula de ADN se romperá en fragmentos.
Corte escalonado
No todas las endonucleasas de restricción cortan simétricamente y dejan extremos romos como Hind II descrito anteriormente. Muchas endonucleasas escinden las cadenas principales del ADN en posiciones que no son directamente opuestas entre sí, creando proyecciones. Por ejemplo, la nucleasa Eco RI tiene la secuencia de reconocimiento 5'—GAATTC—3'
.
Enzima | Fuente | Secuencia de reconocimiento | Cortar |
---|---|---|---|
Hind III | Haemophilus influenzae | 3'– TTCGAA – 5' | 3'– TTCGA A –5' |
Eco RI | Escherichia coli | 3'– CTTAAG – 5' | 3'– CTTAA G –5' |
Bam HI | Bacillus amyloliquefaciens | 3'– CCTAGG – 5' | 3'– CCTAG G –5' |
Cuando la enzima encuentra esta secuencia, escinde cada esqueleto entre los residuos de base G y A más cercanos. Una vez que se han realizado los cortes, los fragmentos resultantes se mantienen unidos solo por los enlaces de hidrógeno relativamente débiles que mantienen las bases complementarias entre sí. La debilidad de estos enlaces permite que los fragmentos de ADN se separen entre sí. Cada fragmento resultante tiene un extremo 5 'que sobresale compuesto de bases no apareadas. Otras enzimas crean cortes en la columna vertebral del ADN que dan como resultado extremos 3 'sobresalientes. Los extremos que sobresalen, tanto 3 'como 5', a veces se denominan " extremos pegajosos " porque tienden a unirse con secuencias complementarias de bases. En otras palabras, si una longitud de bases 5'—AATT—3'
no apareada encuentra otra longitud no apareada con la secuencia, 3'—TTAA—5'
se unirán entre sí: son "pegajosas" entre sí. La enzima ligasa se usa luego para unir las cadenas principales de fosfato de las dos moléculas. El origen celular, o incluso el origen de la especie, de los extremos pegajosos no afecta su pegajosidad. Cualquier par de secuencias complementarias tenderá a unirse, incluso si una de las secuencias proviene de una longitud de ADN humano y la otra proviene de una longitud de ADN bacteriano. De hecho, es esta cualidad de adherencia la que permite la producción de moléculas de ADN recombinante, moléculas que se componen de ADN de diferentes fuentes y que ha dado lugar a la tecnología de la ingeniería genética .
Papel en la naturaleza
Reparación de ADN
Dado que todas las células dependen del ADN como medio de información genética, el control de la calidad genética es una función esencial de todos los organismos. La replicación del ADN es un proceso propenso a errores, y las propias moléculas de ADN son vulnerables a la modificación de muchos factores estresantes metabólicos y ambientales. Los ejemplos ubicuos incluyen especies reactivas de oxígeno , casi ultravioleta y radiación ionizante . Muchas nucleasas participan en la reparación del ADN reconociendo los sitios dañados y escindiéndolos del ADN circundante. Estas enzimas funcionan de forma independiente o en complejos . La mayoría de las nucleasas implicadas en la reparación del ADN no son específicas de secuencia. Reconocen los sitios de daño a través de la deformación de la estructura secundaria del ADN bicatenario (dsDNA). [5]
Revisión de réplicas
Durante la replicación del ADN , las ADN polimerasas alargan nuevas hebras de ADN frente a hebras de plantilla complementarias. La mayoría de las ADN polimerasas comprenden dos dominios enzimáticos diferentes : una polimerasa y una exonucleasa correctora . La polimerasa alarga la nueva hebra en la dirección 5 '→ 3'. La exonucleasa elimina los nucleótidos erróneos de la misma hebra en la dirección 3 '→ 5'. Esta actividad de exonucleasa es esencial para la capacidad de una ADN polimerasa de corregir. Las deleciones que inactivan o eliminan estas nucleasas aumentan las tasas de mutación y mortalidad en los microbios afectados y el cáncer en ratones. [8]
Bifurcación de replicación detenida
Muchas formas de daño del ADN detienen la progresión de la horquilla de replicación , lo que hace que las ADN polimerasas y la maquinaria asociada abandonen la horquilla. Luego debe ser procesado por proteínas específicas del tenedor. El más notable es MUS81 . Las deleciones que causan los rayos UV o la metilación dañan la sensibilidad en la levadura , además de los defectos meióticos. [5]
Procesamiento de fragmentos de Okazaki
Una tarea omnipresente en las células es la eliminación de los cebadores de ARN del fragmento Okazaki de la replicación. La mayoría de tales cebadores se escindieron de recién sintetizado filamento de revestimiento de ADN por endonucleasas de la familia RNasa H . En eucariotas y arqueas , la endonucleasa de colgajo FEN1 también participa en el procesamiento de fragmentos de Okazaki. [5]
Reparación de desajustes
La reparación de los errores de emparejamiento del ADN en cualquier organismo dado se efectúa mediante un conjunto de endonucleasas específicas de los errores de emparejamiento. En los procariotas, esta función la desempeñan principalmente MutSLH y proteínas asociadas a la reparación de parches muy cortos (reparación de VSP).
El sistema MutSLH (que comprende MutS , MutL y MutH) corrige mutaciones puntuales y pequeños giros . MutS reconoce y se une a los desajustes, donde recluta MutL y MutH. MutL media la interacción entre MutS y MutH, y mejora la actividad endonucleásica de este último. MutH reconoce los 5'—GATC—3'
sitios hemimetilados y se escinde junto al G
de la hebra no metilada (la hebra sintetizada más recientemente).
La reparación de VSP es iniciada por la endonucleasa Vsr. Corrige un T/G
desajuste específico causado por la desaminación espontánea de citosinas metiladas a timinas. Vsr reconoce la secuencia , donde corta la hebra de ADN en el lado 5 'de la timina que no coincide (subrayada en la secuencia anterior). Una de las exonucleasas RecJ, ExoVII o ExoI luego degrada el sitio antes de que la ADN polimerasa resintetice el espacio en la hebra. [5]5'—CTWGG—3'
Reparación de escisión de base
La formación de sitios AP es una ocurrencia común en dsDNA. Es el resultado de la hidrólisis espontánea y la actividad de las glicosilasas de ADN como un paso intermedio en la reparación de la escisión de bases . Estos sitios AP son eliminados por endonucleasas AP , que efectúan roturas de hebra única alrededor del sitio. [5]
Reparación por escisión de nucleótidos
La reparación por escisión de nucleótidos , que no debe confundirse con la reparación por escisión de la base, implica la eliminación y reemplazo de los nucleótidos dañados. Los casos de reticulación , aductos y lesiones (generadas por luz ultravioleta o especies reactivas de oxígeno ) pueden desencadenar esta vía de reparación. Los tramos cortos de ADN monocatenario que contienen tal nucleótido dañado se eliminan del ADN dúplex mediante endonucleasas separadas que efectúan cortes aguas arriba y aguas abajo del daño. Las deleciones o mutaciones que afectan a estas nucleasas provocan una mayor sensibilidad al daño ultravioleta y la carcinogénesis. Tales anomalías pueden incluso afectar el desarrollo neuronal.
En bacterias, ambos cortes ejecutados por el complejo UvrB-UvrC . En la levadura en ciernes, Rad2 y el complejo Rad1-Rad10 hacen los cortes de 5 'y 3', respectivamente. En los mamíferos, los homólogos XPG y XPF - ERCC1 afectan las mismas mellas respectivas. [9]
Reparación de rotura de doble hilo
Las roturas de doble hebra , tanto intencionales como no intencionales, ocurren regularmente en las células. Las roturas involuntarias se generan comúnmente por radiación ionizante , diversos agentes químicos exógenos y endógenos y horquillas de replicación detenidas. Las rupturas intencionales se generan como intermediarios en la meiosis y la recombinación V (D) J , que se reparan principalmente mediante recombinación homóloga y unión de extremos no homólogos . Ambos casos requieren que los extremos de las roturas de doble hebra sean procesados por nucleasas antes de que pueda tener lugar la reparación. Una de estas nucleasas es Mre11 complejada con Rad50 . Las mutaciones de Mre11 pueden precipitar un trastorno similar a la ataxia-telangiectasia . [9]
La recombinación V (D) J implica la apertura de estructuras de bucles de tallo asociadas con roturas de doble hebra y, posteriormente, unir ambos extremos. El complejo Artemis-DNAPK cs participa en esta reacción. Aunque Artemis exhibe actividad de exonucleasa de ssDNA 5 '→ 3' cuando está sola, su complejación con DNA-PK cs permite el procesamiento endonucleásico de los bucles de tallo. Los defectos de cualquiera de las proteínas confieren inmunodeficiencia grave. [9]
La recombinación homóloga, por otro lado, implica dos dúplex de ADN homólogos conectados por bucles D o uniones de Holliday . En las bacterias, las endonucleasas como RuvC resuelven las uniones de Holliday en dos dsDNA separados escindiendo las uniones en dos sitios simétricos cerca del centro de la unión. En eucariotas, FEN1 , XPF - ERCC1 y MUS81 escinden los bucles D, y Cce1 / Ydc2 procesa las uniones de Holliday en las mitocondrias. [9]
Meganucleasas
La frecuencia a la que una nucleasa particular cortará una molécula de ADN determinada depende de la complejidad del ADN y de la longitud de la secuencia de reconocimiento de la nucleasa; debido a la probabilidad estadística de encontrar las bases en un orden particular por casualidad, una secuencia de reconocimiento más larga resultará en una digestión menos frecuente. Por ejemplo, se predeciría que una secuencia de cuatro bases dada (correspondiente al sitio de reconocimiento para una nucleasa hipotética) ocurrirá cada 256 pares de bases en promedio (donde 4 ^ 4 = 256), pero se esperaría cualquier secuencia de seis bases dada que ocurra una vez cada 4096 pares de bases en promedio (4 ^ 6 = 4096).
Una familia única de nucleasas son las meganucleasas , que se caracterizan por tener secuencias de reconocimiento más grandes y, por lo tanto, menos comunes que constan de 12 a 40 pares de bases. Estas nucleasas son particularmente útiles para aplicaciones de ingeniería genética y de ingeniería del genoma en organismos complejos como plantas y mamíferos, donde genomas típicamente más grandes (numerados en miles de millones de pares de bases) resultarían en una digestión frecuente y deletérea de sitios específicos usando nucleasas tradicionales.
Ver también
- HindIII
- Ligase
- Nucleasa microcócica
- Ensayo de protección de nucleasas
- Nucleasa P1
- Dominio PIN
- Polimerasa
- Nucleasa S1
Referencias
- ^ Nishino T, Morikawa K (diciembre de 2002). "Estructura y función de las nucleasas en la reparación del ADN: forma, agarre y hoja de las tijeras de ADN" . Oncogén . 21 (58): 9022–32. doi : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ a b Rittié L, Perbal B (junio de 2008). "Enzimas utilizadas en biología molecular: una guía útil" . Revista de Comunicación y Señalización Celular . 2 (1–2): 25–45. doi : 10.1007 / s12079-008-0026-2 . PMC 2570007 . PMID 18766469 .
- ^ Linn S, Arber W (abril de 1968). "Host especificidad del ADN producido por Escherichia coli, X. Restricción in vitro de la forma replicativa del fago fd" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 59 (4): 1300-6. doi : 10.1073 / pnas.59.4.1300 . PMC 224867 . PMID 4870862 .
- ^ Arber W., Linn S. (1969). "Modificación y restricción del ADN". Revisión anual de bioquímica . 38 : 467–500. doi : 10.1146 / annurev.bi.38.070169.002343 . PMID 4897066 .
- ^ a b c d e f Nishino T, Morikawa K (diciembre de 2002). "Estructura y función de las nucleasas en la reparación del ADN: forma, agarre y hoja de las tijeras de ADN" . Oncogén . 21 (58): 9022–32. doi : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ Winkler FK, Banner DW, Oefner C, Tsernoglou D, Brown RS, Heathman SP, et al. (Mayo de 1993). "La estructura cristalina de la endonucleasa EcoRV y de sus complejos con fragmentos de ADN afines y no afines" . El diario EMBO . 12 (5): 1781–95. doi : 10.2210 / pdb4rve / pdb . PMC 413397 . PMID 8491171 .
- ^ a b c d Nishino T, Morikawa K (diciembre de 2002). "Estructura y función de las nucleasas en la reparación del ADN: forma, agarre y hoja de las tijeras de ADN" . Oncogén . 21 (58): 9022–32. doi : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ Nishino T, Morikawa K (diciembre de 2002). "Estructura y función de las nucleasas en la reparación del ADN: forma, agarre y hoja de las tijeras de ADN" . Oncogén . 21 (58): 9022–32. doi : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ a b c d Nishino T, Morikawa K (diciembre de 2002). "Estructura y función de las nucleasas en la reparación del ADN: forma, agarre y hoja de las tijeras de ADN" . Oncogén . 21 (58): 9022–32. doi : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
enlaces externos
- Ejemplos de tabla de enzimas de restricción
- Acción enzimática de restricción de EcoRI
- Glosario de enzimas
- Nucleasas (Fuente principal de la página ...)