Las hidroxilasas dependientes de alfa-cetoglutarato son una clase principal de proteínas de hierro no hemo que catalizan una amplia gama de reacciones. Estas reacciones incluyen reacciones de hidroxilación, desmetilaciones, expansiones de anillos, cierres de anillos y desaturaciones. [1] [2] Funcionalmente, las hidroxilasas dependientes de αKG son comparables a las enzimas del citocromo P450 . Ambos usan O 2 y equivalentes reductores como cosustratos y ambos generan agua. [3]
Función biológica
Las hidroxilasas dependientes de αKG tienen diversas funciones. [4] [5] En microorganismos como las bacterias, las dioxigenasas dependientes de αKG están involucradas en muchas vías biosintéticas. [6] [7] [8] En las plantas, las dioxigenasas dependientes de αKG están involucradas en diversas reacciones en el metabolismo de las plantas. [9] Estos incluyen la biosíntesis de flavonoides, [10] y la biosíntesis de etileno. [11] En mamíferos y seres humanos, la dioxigenasa dependiente de αKG tiene funciones funcionales en la biosíntesis (por ejemplo, biosíntesis de colágeno [12] y biosíntesis de L-carnitina [13] ), modificaciones postraduccionales (por ejemplo, hidroxilación de proteínas [14] ), regulaciones epigenéticas ( por ejemplo, desmetilación de histonas y ADN [15] ), así como sensores de metabolismo energético . [dieciséis]
Muchas dioxigenasas dependientes de αKG también catalizan el recambio desacoplado, en el que la descarboxilación oxidativa de αKG en succinato y dióxido de carbono se produce en ausencia de sustrato. La actividad catalítica de muchas dioxigenasas dependientes de αKG depende de agentes reductores (especialmente ascorbato), aunque no se comprenden las funciones exactas. [17] [18]
Mecanismo catalítico
Las dioxigenasas dependientes de αKG catalizan reacciones de oxidación incorporando un solo átomo de oxígeno del oxígeno molecular (O 2 ) en sus sustratos. Esta conversión se combina con la oxidación del cosustrato αKG en succinato y dióxido de carbono. [1] [2] Con O 2 etiquetado como sustrato, aparece una etiqueta en el succinato y otra en el sustrato hidroxilado: [19] [20]
- R 3 CH + O 2 + - O 2 CC (O) CH 2 CH 2 CO 2 - → R 3 C O H + CO 2 + - O O CCH 2 CH 2 CO 2 -
El primer paso implica la unión de αKG y sustrato al sitio activo. αKG se coordina como un ligando bidentado de Fe (II), mientras que el sustrato se mantiene por fuerzas no covalentes en estrecha proximidad. Posteriormente, el oxígeno molecular se une en el extremo a Fe cis a los dos donantes de αKG. El extremo descoordinado del ligando superóxido ataca el cetocarbono, induciendo la liberación de CO 2 y formando un intermedio Fe (IV) -oxo . Este centro Fe = O oxigena el sustrato mediante un mecanismo de rebote de oxígeno . [1] [2]
Los mecanismos alternativos no han logrado obtener apoyo. [21]
Estructura
Proteína
Todas las dioxigenasas dependientes de αKG contienen un pliegue de hélice β bicatenaria conservada (DSBH, también conocida como cupina), que se forma con dos láminas β. [22] [23]
Metalocofactor
El sitio activo contiene un motivo de tríada de residuos de aminoácidos de 2-His-1-carboxilato (HXD / E ... H) altamente conservado, en el que el Fe (II) catalíticamente esencial está retenido por dos residuos de histidina y un ácido aspártico / residuo de ácido glutámico. La tríada N 2 O se une a una cara del centro Fe, dejando tres sitios lábiles disponibles en el octaedro para unirse a αKG y O 2 . [1] [2] En la cisteína dioxigenasa se encuentra un motivo de unión de Fe facial similar, pero con una matriz his-his-his .
Unión de sustrato y cosustrato
La unión de αKG y el sustrato se ha analizado mediante cristalografía de rayos X, cálculos de dinámica molecular y espectroscopia de RMN. Se ha observado la unión del cetoglutarato utilizando inhibidores enzimáticos. [24]
Algunas dioxigenasas dependientes de αKG se unen a su sustrato mediante un mecanismo de ajuste inducido. Por ejemplo, se han observado cambios estructurales significativos en las proteínas al unirse al sustrato para la isoforma 2 de prolil hidroxilasa humana (PHD2), [25] [26] [27] una dioxigenasa dependiente de αKG que participa en la detección de oxígeno, [28] e isopenicilina N sintasa (IPNS), una dioxigenasa microbiana dependiente de αKG. [29]
Inhibidores
Dadas las importantes funciones biológicas que desempeñan las dioxigenasa dependiente de αKG, se desarrollaron muchos inhibidores de dioxigenasa dependiente de αKG. Los inhibidores que se usaron regularmente para atacar la dioxigenasa dependiente de αKG incluyen N-oxalilglicina (NOG), ácido piridina-2,4-dicarboxílico (2,4-PDCA), 5-carboxi-8-hidroxiquinolina, FG-2216 y FG- 4592, que fueron diseñados para imitar el cosustrato αKG y competir contra la unión de αKG en el sitio activo de la enzima Fe (II). [30] [31] Aunque son potentes inhibidores de la dioxigenasa dependiente de αKG, carecen de selectividad y, por lo tanto, a veces se les llama inhibidores de "amplio espectro". [32] También se desarrollaron inhibidores que compiten contra el sustrato, como los inhibidores basados en peptidilo que se dirigen al dominio 2 de la prolilhidroxilasa humana (PHD2) [33] y Mildronate , una molécula de fármaco que se usa comúnmente en Rusia y Europa del Este que se dirige a la gamma -butirobetaína dioxigenasa . [34] [35] [36]
Ensayos
Se desarrollaron muchos ensayos para estudiar las dioxigenasas dependientes de αKG de modo que se pueda obtener información como la cinética enzimática, la inhibición enzimática y la unión del ligando. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se aplica ampliamente para estudiar dioxigenasas dependientes de αKG. [37] Por ejemplo, se desarrollaron ensayos para estudiar la unión de ligandos, [38] [39] [40] cinética enzimática, [41] modos de inhibición [42] así como el cambio conformacional de proteínas. [43] La espectrometría de masas también se aplica ampliamente. Se puede utilizar para caracterizar la cinética enzimática, [44] para guiar el desarrollo de inhibidores enzimáticos, [45] estudiar la unión de ligandos y metales [46] , así como analizar el cambio conformacional de proteínas. [47] También se utilizaron ensayos que utilizan espectrofotometría, [48] por ejemplo, los que miden la oxidación 2OG, [49] la formación de coproductos de succinato [50] o la formación de productos. [51] También se aplicaron otras técnicas biofísicas que incluyen (pero no se limitan a) calorimetría de titulación isotérmica (ITC) [52] y resonancia paramagnética electrónica (EPR). [53] También se desarrollaron y utilizaron ensayos radiactivos que utilizan sustratos marcados con 14 C. [54] Dado que las dioxigenasas dependientes de αKG requieren oxígeno para su actividad catalítica, también se aplicó el ensayo de consumo de oxígeno. [55]
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