La masa molar absoluta es un proceso que se utiliza para determinar las características de las moléculas .
Historia
Las primeras mediciones absolutas de pesos moleculares (es decir, realizadas sin referencia a patrones) se basaron en características físicas fundamentales y su relación con la masa molar. Los más útiles fueron la osmometría de membrana y la sedimentación .
Otro enfoque instrumental absoluto también fue posible con el desarrollo de la teoría de la dispersión de la luz por Albert Einstein , Chandrasekhara Venkata Raman , Peter Debye , Bruno H. Zimm y otros. El problema con las mediciones realizadas mediante osmometría de membrana y sedimentación era que solo caracterizaban las propiedades generales de la muestra de polímero . Además, las mediciones consumían demasiado tiempo y eran propensas a errores del operador . Con el fin de obtener información sobre una mezcla polidispersa de masas molares, se desarrolló un método para separar los diferentes tamaños. Esto se logró mediante el advenimiento de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). SEC se basa en el hecho de que los poros del material de relleno de las columnas de cromatografía podrían hacerse lo suficientemente pequeños como para que las moléculas se alojen temporalmente en sus espacios intersticiales. A medida que la muestra se abre paso a través de una columna, las moléculas más pequeñas pasan más tiempo viajando en estos espacios vacíos que las más grandes, que tienen menos lugares para "deambular". El resultado es que una muestra se separa según su volumen hidrodinámico. . Como consecuencia, las moléculas grandes salen primero y luego las pequeñas siguen en el eluyente. Al elegir un material de relleno de columna adecuado, es posible definir la resolución del sistema. Las columnas también se pueden combinar en serie para aumentar la resolución o la gama de tamaños estudiados.
El siguiente paso es convertir el tiempo en el que las muestras eluyeron en una medida de masa molar. Esto es posible porque si se conociera la masa molar de un patrón, el tiempo en el que este patrón eluyó debería ser igual a una masa molar específica. Usando múltiples estándares, se puede desarrollar una curva de calibración de tiempo versus masa molar. Esto es importante para el análisis de polímeros porque podría demostrarse que un solo polímero tiene muchos componentes diferentes, y cuya complejidad y distribución también afectarían las propiedades físicas. Sin embargo, esta técnica tiene deficiencias. Por ejemplo, las muestras desconocidas siempre se miden en relación con estándares conocidos, y estos estándares pueden o no tener similitudes con la muestra de interés. Las mediciones realizadas por SEC se convierten luego matemáticamente en datos similares a los encontrados por las técnicas existentes.
El problema fue que el sistema se calibró de acuerdo con las características Vh de los patrones de polímero que no están directamente relacionados con la masa molar. Si la relación entre la masa molar y Vh del estándar no es la misma que la de la muestra desconocida, la calibración no es válida. Por tanto, para ser exactos, la calibración debe utilizar el mismo polímero, de la misma conformación, en el mismo eluyente y tener la misma interacción con el disolvente a medida que la capa de hidratación cambia Vh.
Benoit y col. demostró que teniendo en cuenta el volumen hidrodinámico se solucionaría el problema. En su publicación, Benoit mostró que todos los polímeros sintéticos eluyen en la misma curva cuando el logaritmo de la viscosidad intrínseca multiplicado por la masa molar se representa frente al volumen de elución. Esta es la base de la calibración universal que requiere un viscosímetro para medir la viscosidad intrínseca de los polímeros. Se demostró que la calibración universal funciona para polímeros ramificados, copolímeros y polímeros en forma de estrella.
Para una buena cromatografía, no debe haber interacción con la columna más que la producida por el tamaño. A medida que aumentaban las demandas sobre las propiedades del polímero, también aumentaba la necesidad de obtener información absoluta sobre la masa y el tamaño molar. Esto fue especialmente importante en aplicaciones farmacéuticas donde cambios leves en la masa molar (por ejemplo, agregación ) o en la forma pueden dar como resultado una actividad biológica diferente . Estos cambios pueden tener un efecto dañino en lugar de beneficioso.
Para obtener la masa molar, los instrumentos de dispersión de luz deben medir la intensidad de la luz dispersa en ángulo cero. Esto no es práctico ya que la fuente láser eclipsaría la intensidad de dispersión de la luz en un ángulo cero. Las 2 alternativas son medir muy cerca de un ángulo cero o medir en muchos ángulos y extrapolar usando un modelo (Rayleigh, Rayleigh-Gans-Debye, Berry, Mie, etc.) a un ángulo de cero grados.
Los instrumentos tradicionales de dispersión de luz funcionaban tomando lecturas desde múltiples ángulos, cada uno medido en serie. A principios de la década de 1970 se desarrolló un sistema de dispersión de luz de ángulo bajo que permitía usar una sola medición para calcular la masa molar. Aunque las mediciones en ángulos bajos son mejores por razones físicas fundamentales (las moléculas tienden a dispersar más luz en direcciones de ángulos más bajos que en ángulos más altos), los eventos de dispersión de ángulos bajos causados por el polvo y la contaminación de la fase móvil superan fácilmente la dispersión de las moléculas de interés. . Cuando la dispersión de luz láser de ángulo bajo (LALLS) se hizo popular en la década de 1970 y mediados de la de 1980, los filtros desechables de buena calidad no estaban fácilmente disponibles y, por lo tanto, las mediciones de múltiples ángulos ganaron popularidad.
La dispersión de luz de múltiples ángulos se inventó a mediados de la década de 1980 e instrumentos como ese pudieron realizar mediciones en los diferentes ángulos simultáneamente, pero no fue hasta finales de la década de 1980 (10-12) [ aclarar ] que la conexión del láser de múltiples ángulos Los detectores de dispersión de luz (MALS) a los sistemas SEC fue una propuesta práctica que permitió determinar tanto la masa molar como el tamaño de cada segmento de la fracción de polímero.
Aplicaciones
Las mediciones de dispersión de luz se pueden aplicar a polímeros sintéticos , proteínas , productos farmacéuticos y partículas como liposomas , micelas y proteínas encapsuladas. Las mediciones se pueden realizar en uno de dos modos que no están fraccionados (modo por lotes) o en modo de flujo continuo (con SEC, HPLC o cualquier otro método de fraccionamiento de flujo ). Los experimentos en modo por lotes se pueden realizar inyectando una muestra en una celda de flujo con una jeringa o con el uso de viales discretos. Estas medidas se utilizan con mayor frecuencia para medir eventos cronometrados como reacciones de anticuerpo-antígeno o ensamblaje de proteínas . Las mediciones en modo lote también se pueden usar para determinar el segundo coeficiente virial (A2), un valor que da una medida de la probabilidad de cristalización o agregación en un solvente dado. Los experimentos de flujo continuo se pueden utilizar para estudiar material que se eluye de prácticamente cualquier fuente. De manera más convencional, los detectores se acoplan a una variedad de diferentes sistemas de separación cromatográfica. La capacidad para determinar la masa y el tamaño de los materiales que eluyen combina la ventaja del sistema de separación con una medición absoluta de la masa y el tamaño de las especies que eluyen.
La adición de un detector SLS acoplado aguas abajo a un sistema cromatográfico permite la utilidad de SEC o separación similar combinada con la ventaja de un método de detección absoluta. Los datos de dispersión de luz dependen puramente de la señal de dispersión de luz multiplicada por la concentración; el tiempo de elución es irrelevante y la separación se puede cambiar para diferentes muestras sin recalibrar. Además, también se puede utilizar un método de separación sin tamaños como HPLC o IC. Como el detector de dispersión de luz depende de la masa, se vuelve más sensible a medida que aumenta la masa molar. Por tanto, es una excelente herramienta para detectar agregaciones. Cuanto mayor sea el número de agregación, más sensible se vuelve el detector.
Método de dispersión de luz de ángulo bajo (láser) (LALS)
Las mediciones de LALS miden en un ángulo muy bajo donde el vector de dispersión es casi cero. LALS no necesita ningún modelo para ajustarse a la dependencia angular y, por lo tanto, proporciona mediciones de pesos moleculares más confiables para moléculas grandes. LALS por sí solo no da ninguna indicación del radio cuadrático medio de la raíz.
Método de dispersión de luz de múltiples ángulos (láser) (MALS)
Las mediciones de MALS funcionan calculando la cantidad de luz dispersa en cada ángulo detectado. El cálculo se basa en la intensidad de la luz medida y la eficiencia cuántica de cada detector. Luego, se usa un modelo para aproximar la intensidad de la luz dispersa en un ángulo cero. La luz de ángulo cero dispersada se relaciona entonces con la masa molar.
Como se señaló anteriormente, el detector MALS también puede proporcionar información sobre el tamaño de la molécula. Esta información es el radio cuadrático medio de la molécula (RMS o Rg). Esto es diferente del Rh mencionado anteriormente que está teniendo en cuenta la capa de hidratación. El radio cuadrático medio puramente matemático se define como los radios que forman la molécula multiplicados por la masa en ese radio.
Bibliografía
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