Las moléculas afímeras [1] son proteínas pequeñas que se unen a moléculas diana con una especificidad y afinidad similares a las de los anticuerpos. [2] [3] Estas proteínas que no se unen a anticuerpos están diseñadas para imitar las características de reconocimiento molecular de los anticuerpos monoclonales en diferentes aplicaciones. [2] [4] Además, estos reactivos de afinidad se han optimizado para aumentar su estabilidad, [5] hacerlos tolerantes a un rango de temperaturas y pH, [6] reducir su tamaño y aumentar su expresión en E. coli y células de mamíferos. [2]
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Desarrollo
Las proteínas afímeras se desarrollaron inicialmente en la Unidad de Células de Cáncer de MRC en Cambridge y luego en dos laboratorios de la Universidad de Leeds . [7] [8] [9] [10] Derivadas de la familia de cistatinas inhibidoras de cisteína proteasa , que funcionan en la naturaleza como inhibidores de cisteína proteasa, [11] [12] estas proteínas de 12 a 14 kDa comparten la estructura terciaria común de un hélice alfa que se encuentra en la parte superior de una hoja beta antiparalela . [13]
Las proteínas afímeras muestran dos bucles peptídicos y una secuencia N-terminal que pueden aleatorizarse para unirse a las proteínas diana deseadas con alta afinidad y especificidad, [5] de manera similar a los anticuerpos monoclonales . La estabilización de los dos péptidos por el armazón proteico limita las posibles conformaciones que pueden adoptar los péptidos, aumentando la afinidad y especificidad de unión en comparación con las bibliotecas de péptidos libres.
Producción
Se utilizan bibliotecas de presentación de fagos de 10 10 secuencias de interacción de diana potenciales aleatorizadas [14] para seleccionar proteínas Affimer que exhiben una unión de alta especificidad a la proteína diana con afinidades de unión en el rango nM . [5] [15] [16] La capacidad de dirigir técnicas de cribado in vitro permite la identificación de aglutinantes Affimer altamente específicos y de alta afinidad, anulando los requisitos para la maduración por afinidad de estos reactivos. El cribado y el desarrollo in vitro también significan que el espacio objetivo para los aglutinantes Affimer no está limitado por el sistema inmunológico del animal huésped . Debido a que las proteínas Affimer se generan utilizando sistemas recombinantes, su generación es significativamente más rápida y reproducible en comparación con la producción de anticuerpos tradicionales . [17]
Se han generado formas multiméricas de proteínas Affimer y se ha demostrado que producen volúmenes titrimétricos en el rango de 200 a 400 mg / L en cultivo a pequeña escala utilizando sistemas hospedadores bacterianos. Las formas multiméricas de proteínas Affimer con la misma especificidad de la diana proporcionaron efectos de avidez en la unión de la diana, mientras que la fusión de diferentes proteínas Affimer con diferentes especificidades de la diana permitiría proteínas de afinidad multiespecíficas. [18]
Muchas etiquetas y proteínas de fusión diferentes, como fluoróforos , ADN monocatenario, His y etiquetas c-Myc pueden conjugarse fácilmente con proteínas Affimer. [2] [19] [20] [21] [22] [23] Se pueden introducir residuos de cisteína específicos en la proteína para permitir que la química del tiol oriente uniformemente las proteínas Affimer sobre un soporte sólido con el fin de aumentar la captura de la diana en la unión del ligando ensayos y biosensores. [5] [15] [17] [24] [25] Esta funcionalización flexible de la molécula Affimer maximiza el rendimiento de los reactivos Affimer en múltiples aplicaciones y formatos de ensayo.
Propiedades
Los aglutinantes afímeros son proteínas recombinantes. Muestran las características robustas de alta termoestabilidad, con temperaturas de fusión superiores a 80 ° C, [10] resistencia a pH extremos (2–13,7), [10] ciclos de congelación-descongelación y liofilización. El bajo peso molecular de los aglutinantes Affimer significa que pueden evitarse los problemas de impedimento estérico, que se observan típicamente con los anticuerpos. [2] Como se fabrican utilizando procesos de producción de bacterias recombinantes, la consistencia de un lote a otro se mantiene para los reactivos Affimer, superando algunos de los problemas de reproducibilidad y seguridad del suministro. [2] [3] [17] [26] [27]
Estos anticuerpos sintéticos fueron diseñados para ser estables, no tóxicos, biológicamente neutros y no contienen modificaciones postraduccionales ni puentes disulfuro . [7] [8] [10] Dos secuencias de bucle separadas, que incorporan un total de 12 a 36 aminoácidos, forman la superficie de interacción del objetivo, por lo que las superficies de interacción pueden oscilar entre 650 y 1000 Å . Se supone que la gran superficie de interacción da como resultado una unión altamente específica y de alta afinidad a las proteínas diana. [5] [7] [10] [15] [17] [19] [28] [29] [30] [31] Como resultado, las moléculas de afímero pueden distinguir entre proteínas que difieren en un solo aminoácido , pueden detectan cambios sutiles en los niveles de expresión de proteínas incluso en un formato multiplexado y pueden distinguir entre múltiples dominios de proteínas estrechamente relacionados . [2] [24] [31] [32] [33]
Aplicaciones
La tecnología Affimer ha sido comercializada y desarrollada por Avacta, quienes están desarrollando estos reactivos de afinidad como herramientas para la investigación y el diagnóstico y como bioterapéuticos.
Reactivos y diagnósticos
Los aglutinantes afímeros se han utilizado en varias plataformas, como ELISA , [2] [17] [34] resonancia de plasmón superficial , [32] [34] [35] [36] purificación por afinidad , [2] [34] [37 ] inmunohistoquímica [2] e inmunocitoquímica , incluidas las imágenes de superresolución . [2] [19] [20] [21] Los reactivos afímeros que inhiben las interacciones proteína-proteína también pueden producirse con el potencial de expresar estos inhibidores en células de mamíferos para investigar y modificar las vías de señalización. [2] [32] [35] [38] [39] También se han cocristalizado en un complejo con proteínas diana, [32] [35] [40] lo que permite el descubrimiento de fármacos mediante pruebas de detección y desplazamiento in silico . [14]
Los reactivos afímeros son adecuados para su uso en biosensores, [5] [15] [24] [25] diagnósticos en el punto de atención y como reactivos antiidiotípicos en ensayos de monitorización farmacocinética y terapéutica de fármacos. [26] [27] [31] [41] [42]
Terapéutica
El armazón de la proteína Affimer se ha desarrollado como bioterapéutico . El pequeño tamaño y el perfil de estabilidad de las proteínas Affimer combinadas con su origen humano confieren propiedades similares a las de un fármaco a las moléculas Affimer. Esto puede representar ventajas sobre los anticuerpos en términos de penetración tisular, por ejemplo, en tumores sólidos o para la administración tópica no invasiva , como la administración por inhalación o la aplicación dérmica. [18]
Las proteínas afímeras pueden conjugarse fácilmente para formar multímeros y funcionalizarse fácilmente para el diseño de agentes terapéuticos con características específicas deseadas. Los ejemplos incluyen la producción de moléculas Affimer multiespecíficas para apuntar y reclutar células específicas, la fusión con fragmentos Fc o aglutinantes de albúmina para ajustar su vida media in vivo y para usar como el resto de dirección en receptores quiméricos o modificados para transportar una toxina en Affimer -conjugados de fármacos. [16] [18] [43]
Las terapias Affimer están en descubrimiento y desarrollo preclínico para abordar los trastornos de la coagulación sanguínea , la resistencia a los antibióticos , los modelos de descubrimiento de fármacos fenotípicos y el cáncer , tanto a través de la terapia con células CAR-T como como inhibidores de puntos de control inmunológico . [18] [44] [45] [46] Los primeros estudios que utilizaron muestras humanas ex vivo mostraron una baja inmunogenicidad asociada con el andamio Affimer, a niveles comparables a los de un anticuerpo terapéutico comercializado. [47] Además, los estudios preclínicos iniciales mostraron una buena eficacia y tolerabilidad de la terapia Affimer inmuno-oncológica anti-PDL1 en ratones. Se anticipa que la presentación de IND para el primer tratamiento de Affimer ocurrirá en 2019/2020. [dieciséis]
Referencias
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enlaces externos
- Avacta
- Introducción a la tecnología Affimer - video