Los aptámeros (del latín aptus - fit y del griego meros - part) son moléculas de oligonucleótidos o péptidos que se unen a una molécula diana específica. Los aptámeros generalmente se crean seleccionándolos de un gran grupo de secuencia aleatoria , pero los aptámeros naturales también existen en los riboswitches . Los aptámeros se pueden utilizar tanto con fines clínicos como de investigación básica como fármacos macromoleculares. Los aptámeros se pueden combinar con ribozimas para autoescindirse en presencia de su molécula diana. Estas moléculas compuestas tienen aplicaciones clínicas, industriales y de investigación adicionales.
Más específicamente, los aptámeros se pueden clasificar como
- Aptámeros de ADN o ARN o XNA . Consisten en hebras (generalmente cortas) de oligonucleótidos.
- Aptámeros de péptidos . Consisten en uno (o más) dominios peptídicos variables cortos, unidos en ambos extremos a un andamio proteico.
Tipos
Ácido nucleico
Los aptámeros de ácidos nucleicos son especies de ácidos nucleicos ( imitadores de anticuerpos de próxima generación ) que tienen una selectividad a la par de los anticuerpos para una diana determinada generada mediante selección in vitro o, de manera equivalente, SELEX ( evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial ) que van desde entidades pequeñas como pesadas iones metálicos a entidades grandes como células. [1] A nivel molecular, los aptámeros se unen a su objetivo afín a través de varias interacciones no covalentes, a saber, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas y adaptación inducida. Los aptámeros son útiles en aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas, ya que ofrecen propiedades de reconocimiento molecular que rivalizan con las de las biomoléculas de uso común, los anticuerpos . Además de su reconocimiento discriminado, los aptámeros ofrecen ventajas sobre los anticuerpos, ya que pueden manipularse completamente en un tubo de ensayo, se producen fácilmente mediante síntesis química, poseen propiedades de almacenamiento deseables y provocan poca o ninguna inmunogenicidad en aplicaciones terapéuticas. [2]
En 1990, dos laboratorios desarrollaron independientemente la técnica de selección: el laboratorio Gold, utilizando el término SELEX para su proceso de selección de ligandos de ARN contra la ADN polimerasa T4 ; y el laboratorio de Szostak, acuñando el término selección in vitro , seleccionando ligandos de ARN frente a varios tintes orgánicos. El laboratorio de Szostak también acuñó el término aptámero (del latín, apto , que significa 'encajar') para estos ligandos basados en ácidos nucleicos. Dos años más tarde, el laboratorio de Szostak y Gilead Sciences , independientes entre sí, utilizaron esquemas de selección in vitro para desarrollar ligandos de ADN monocatenarios para tintes orgánicos y coagulantes humanos, trombina (ver aptámeros antitrombina ), respectivamente. No parece haber diferencias sistemáticas entre los aptámeros de ARN y ADN, salvo la mayor estabilidad química intrínseca del ADN.
La noción de selección in vitro fue precedida más de veinte años antes, cuando Sol Spiegelman usó un sistema de replicación Qbeta como una forma de desarrollar una molécula autorreplicante. [3] Además, un año antes de la publicación de la selección in vitro y SELEX, Gerald Joyce utilizó un sistema que denominó "evolución dirigida" para alterar la actividad de escisión de una ribozima.
Desde el descubrimiento de aptámeros, muchos investigadores han utilizado la selección de aptámeros como medio de aplicación y descubrimiento. En 2001, el proceso de selección in vitro fue automatizado [4] [5] [6] por J. Colin Cox en el laboratorio de Ellington en la Universidad de Texas en Austin , reduciendo la duración de un experimento de selección de seis semanas a tres días. .
Si bien el proceso de ingeniería artificial de ligandos de ácido nucleico es muy interesante para la biología y la biotecnología, la noción de aptámeros en el mundo natural aún no se había descubierto hasta 2002, cuando dos grupos liderados por Ronald Breaker y Evgeny Nudler descubrieron una genética basada en ácidos nucleicos. elemento regulador (que se denominó riboswitch ) que posee propiedades de reconocimiento molecular similares a las de los aptámeros fabricados artificialmente. Además del descubrimiento de un nuevo modo de regulación genética, esto añade más credibilidad a la noción de un " mundo de ARN ", una etapa postulada en el tiempo en los orígenes de la vida en la Tierra.
Tanto los aptámeros de ADN como de ARN muestran fuertes afinidades de unión para varios objetivos. [7] [8] [9] Se seleccionaron aptámeros de ADN y ARN para el mismo objetivo. Estos objetivos incluyen lisozima , [10] trombina , [11] elemento sensible de acción trans del virus de inmunodeficiencia humana (VIH TAR), [12] hemina , [13] interferón γ , [14] factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), [15 ] antígeno prostático específico (PSA), [16] [17] dopamina , [18] y el oncogén no clásico, factor de choque térmico 1 (HSF1). [19] En el caso de la lisozima, el TAR del VIH, el VEGF y la dopamina, el aptámero de ADN es el análogo del aptámero de ARN, con timina reemplazando al uracilo. Los aptámeros de hemina, trombina e interferón γ, ADN y ARN se seleccionaron mediante selecciones independientes y tienen secuencias únicas. Teniendo en cuenta que no todos los análogos de ADN de aptámeros de ARN muestran funcionalidad, la correlación entre la secuencia de ADN y ARN y su estructura y función requiere una mayor investigación.
Últimamente, se ha introducido un concepto de aptámeros inteligentes y ligandos inteligentes en general. Describe aptámeros que se seleccionan con un equilibrio predefinido () , tasa (, ) constantes y parámetros termodinámicos (ΔH, ΔS) de la interacción aptámero-objetivo. La electroforesis capilar cinética es la tecnología utilizada para la selección de aptámeros inteligentes. Obtiene aptámeros en unas pocas rondas de selección.
Los desarrollos recientes en terapias basadas en aptámeros han sido recompensados con el primer fármaco basado en aptámeros aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU . (FDA) para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), llamado Macugen ofrecido por OSI Pharmaceuticals . Además, la empresa NeoVentures Biotechnology Inc. [20] ha comercializado con éxito la primera plataforma de diagnóstico basada en aptámeros para el análisis de micotoxinas en cereales. Muchas empresas contratistas desarrollan aptámeros y aptacuerpos para reemplazar los anticuerpos en la investigación, las plataformas de diagnóstico, el descubrimiento de fármacos y la terapéutica.
Los aptámeros no modificados se eliminan rápidamente del torrente sanguíneo, con una vida media de minutos a horas, principalmente debido a la degradación de las nucleasas y la eliminación del cuerpo por los riñones, como resultado del peso molecular inherentemente bajo del aptámero. Las aplicaciones de aptámeros no modificados se centran actualmente en el tratamiento de afecciones transitorias como la coagulación de la sangre o en el tratamiento de órganos como el ojo donde es posible la administración local. Este rápido aclaramiento puede ser una ventaja en aplicaciones como la formación de imágenes de diagnóstico in vivo . Un ejemplo es un aptámero de unión a tenascina en desarrollo por Schering AG para la formación de imágenes de cáncer. Varias modificaciones, tales como sustituidos con 2 'flúor pirimidinas , polietilenglicol (PEG) de ligamiento, etc. (ambos de los cuales se utilizan en Macugen, un aptámero aprobado por la FDA) están disponibles para los científicos con los que aumentar el suero vida media de aptámeros fácilmente a la escala de tiempo del día o incluso de la semana.
Otro enfoque para aumentar la resistencia a las nucleasas de los aptámeros es desarrollar Spiegelmers , que están compuestos en su totalidad por un esqueleto de ácido L-ribonucleico no natural. Un Spiegelmer de la misma secuencia tiene las mismas propiedades de unión del aptámero de ARN correspondiente, excepto que se une a la imagen especular de su molécula diana.
Además del desarrollo de terapias basadas en aptámeros, muchos investigadores, como el laboratorio de Ellington, han estado desarrollando técnicas de diagnóstico para el perfil de proteínas plasmáticas basadas en aptámeros llamadas proteómica plasmática de aptámeros . Esta tecnología permitirá futuras mediciones de proteínas de múltiples biomarcadores que pueden ayudar a distinguir en el diagnóstico de enfermedades y estados saludables.
Además, el laboratorio de Hirao aplicó una expansión del alfabeto genético utilizando un par de bases no naturales [21] [22] a SELEX y logró la generación de aptámeros de ADN de alta afinidad. [23] Sólo unas pocas bases no naturales hidrófobas como quinta base aumentan significativamente la afinidad del aptámero por las proteínas diana.
Como recurso para todos los experimentos de selección in vitro y SELEX, el laboratorio de Ellington ha desarrollado la base de datos de Aptamer que cataloga todos los experimentos publicados.
Aptámeros divididos
Los aptámeros divididos están compuestos por dos o más cadenas de ADN que imitan segmentos de un aptámero parental más grande. La capacidad de cada hebra componente para unir objetivos dependerá de la ubicación de la muesca y las estructuras secundarias de las hebras hijas, siendo las estructuras más prominentes las uniones de tres vías . [24] La presencia de una molécula diana puede promover el ensamblaje de los fragmentos de ADN. [25] Una vez ensambladas, las hebras se pueden ligar química o enzimáticamente en una sola hebra. Los analitos para los que se han desarrollado aptámeros divididos incluyen la proteína α-trombina , ATP y cocaína . Los aptámeros divididos son una plantilla potencial para los biosensores en analogía con los sistemas de proteínas divididas .
Péptidos
Los aptámeros peptídicos [26] son proteínas artificiales seleccionadas o diseñadas para unirse a moléculas diana específicas. Estas proteínas constan de uno o más bucles de péptidos de secuencia variable mostrados por un andamio de proteínas. Por lo general, se aíslan de bibliotecas combinatorias y, a menudo, se mejoran posteriormente mediante mutación dirigida o rondas de mutagénesis y selección de regiones variables. In vivo , los aptámeros de péptidos pueden unirse a objetivos de proteínas celulares y ejercer efectos biológicos, incluida la interferencia con las interacciones proteicas normales de sus moléculas objetivo con otras proteínas. Se han utilizado bibliotecas de aptámeros peptídicos como " mutágenos ", en estudios en los que un investigador introduce una biblioteca que expresa diferentes aptámeros peptídicos en una población celular, selecciona un fenotipo deseado e identifica aquellos aptámeros que causan el fenotipo. A continuación, el investigador utiliza esos aptámeros como cebos, por ejemplo, en pantallas de levadura de dos híbridos para identificar las proteínas celulares a las que se dirigen esos aptámeros. Tales experimentos identifican proteínas particulares unidas por los aptámeros e interacciones de proteínas que los aptámeros interrumpen para causar el fenotipo. [27] [28] Además, los aptámeros de péptidos derivatizados con restos funcionales apropiados pueden causar una modificación postraduccional específica de sus proteínas objetivo o cambiar la localización subcelular de los objetivos. [29]
Los aptámeros peptídicos también pueden reconocer dianas in vitro . Han encontrado uso en lugar de anticuerpos en biosensores [30] [31] y se utilizan para detectar isoformas activas de proteínas de poblaciones que contienen formas proteicas tanto inactivas como activas. [32] Los derivados conocidos como renacuajos, en los que las "cabezas" de aptámeros de péptidos se unen covalentemente a "colas" de ADN bicatenario de secuencia única, permiten la cuantificación de moléculas diana escasas en mezclas mediante PCR (utilizando, por ejemplo, el método cuantitativo en tiempo real reacción en cadena de la polimerasa ) de sus colas de ADN. [33]
Los péptidos que forman las regiones variables de aptámero se sintetizan como parte de la misma cadena polipeptídica que el armazón y están restringidos en sus extremos N y C por enlace a él. Esta doble restricción estructural disminuye la diversidad de las conformaciones que pueden adoptar las regiones variables, [34] y esta reducción en la diversidad conformacional reduce el costo entrópico de la unión molecular cuando la interacción con el objetivo hace que las regiones variables adopten una conformación única. Como consecuencia, los aptámeros de péptidos pueden unirse estrechamente a sus objetivos, con afinidades de unión comparables a las mostradas por los anticuerpos (rango nanomolar).
Los armazones de aptámeros peptídicos son típicamente proteínas solubles ordenadas y pequeñas. El primer andamio, [26] que todavía se usa ampliamente, [35] es Escherichia coli tiorredoxina , la trxA producto génico (TrxA). En estas moléculas, se muestra un único péptido de secuencia variable en lugar del motivo Gly-Pro en el bucle del sitio activo TrxA -Cys-Gly-Pro-Cys-. Las mejoras de TrxA incluyen la sustitución de serinas por las cisteínas flanqueantes, lo que evita la posible formación de un enlace disulfuro en la base del bucle, la introducción de una sustitución D26A para reducir la oligomerización y la optimización de codones para la expresión en células humanas. [35] [36] Las revisiones de 2015 informaron estudios que utilizaron 12 [35] y 20 [37] otros andamios.
La selección de aptámeros peptídicos se puede realizar utilizando diferentes sistemas, pero el más utilizado actualmente es el sistema de dos híbridos de levadura . Los aptámeros de péptidos también pueden seleccionarse de bibliotecas de péptidos combinatorios construidas mediante presentación de fagos y otras tecnologías de presentación de superficie tales como presentación de ARNm , presentación de ribosomas , presentación de bacterias y presentación de levadura . Estos procedimientos experimentales también se conocen como biopanning . Entre los péptidos obtenidos a partir de biopanning, los mimotopos pueden considerarse como una especie de aptámeros peptídicos. Todos los péptidos seleccionados de bibliotecas de péptidos combinatorios se han almacenado en una base de datos especial con el nombre MimoDB . [38] [39]
Se ha demostrado la selección de aptámeros peptídicos regulados por ligando (LiRPA). Al mostrar péptidos de 7 aminoácidos de una nueva proteína de andamio basada en la estructura trimérica FKBP-rapamicina-FRB, la interacción entre el péptido aleatorizado y la molécula diana puede controlarse mediante la molécula pequeña de rapamicina o análogos no inmunosupresores.
Affimer
La proteína Affimer , un ejemplo de aptámeros peptídicos, es una proteína pequeña y estable diseñada para mostrar bucles de péptidos que proporcionan una superficie de unión para una proteína diana específica. Es una proteína de bajo peso molecular, 12-14 kDa, [40] derivada de la familia de cistatinas inhibidoras de cisteína proteasa . [41] [42] [43] [44]
El andamio Affimer es una proteína estable basada en el pliegue de la proteína cistatina. Muestra dos bucles de péptidos que se pueden asignar al azar para unir diferentes proteínas con alta afinidad. La estabilización del péptido dentro del armazón proteico limita las conformaciones que puede adoptar el péptido. Esto aumenta la afinidad y la especificidad de unión en comparación con las bibliotecas de péptidos libres, pero reduce la capacidad de unión a la diana de la biblioteca.
El andamio de proteínas Affimer se desarrolló inicialmente en la Unidad de Células de Cáncer de MRC en Cambridge y luego en dos laboratorios de la Universidad de Leeds . [41] [42] [43] [44] La tecnología Affimer ha sido comercializada y desarrollada por Avacta Life Sciences.
X-Aptamers
Los X-aptámeros son una nueva generación de aptámeros diseñados para mejorar la unión y versatilidad de los aptámeros regulares basados en ADN / ARN. Los X-aptámeros están diseñados con una combinación de nucleótidos de ADN o ARN naturales y químicamente modificados. Las modificaciones de base permiten la incorporación de varios grupos funcionales / moléculas pequeñas en los aptámeros X, lo que abre una amplia gama de usos y una mayor probabilidad de éxito de unión en comparación con los aptámeros estándar. Las modificaciones del esqueleto de tiofosfato en posiciones seleccionadas mejoran la estabilidad de las nucleasas y la afinidad de unión sin sacrificar la especificidad. [45] [46]
Los X-Aptamers pueden explorar nuevas funciones utilizando un nuevo proceso de selección. A diferencia de SELEX , la selección de X-Aptamer no se basa en múltiples rondas repetidas de amplificación por PCR, sino que implica un proceso de descubrimiento basado en perlas de dos pasos. En el proceso de selección primaria, se crean bibliotecas combinatorias donde cada cuenta llevará aproximadamente 10 ^ 12 copias de una sola secuencia. Las perlas funcionan como portadores, donde las secuencias unidas finalmente se separarán en solución. En el proceso de extracción de la solución secundaria, cada objetivo se utilizará para extraer individualmente las secuencias de unión de la solución. Las secuencias de unión se amplifican, secuencian y analizan. Las secuencias que se enriquecen para cada objetivo se pueden sintetizar y caracterizar. [47] X-aptámeros se producen comercialmente con el nombre de "Raptamers" por una empresa llamada Raptamer Discovery Group. [48]
Desarrollo
AptaBiD
AptaBiD o descubrimiento de biomarcadores facilitado por aptámeros es una tecnología para el descubrimiento de biomarcadores . [49] AptaBiD se basa en la generación de múltiples rondas de un aptámero o un grupo de aptámeros para dianas moleculares diferenciales en las células, lo que facilita la detección exponencial de biomarcadores. Implica tres etapas principales: (i) selección diferencial de múltiples rondas de aptámeros para biomarcadores de células diana; (ii) aislamiento basado en aptámeros de biomarcadores de células diana; y (iii) identificación por espectrometría de masas de biomarcadores. La característica importante de la tecnología AptaBiD es que produce sondas de afinidad sintéticas (aptámeros) simultáneamente con el descubrimiento de biomarcadores. En AptaBiD, los aptámeros se desarrollan para biomarcadores de superficie celular en su estado nativo y conformación. Además de facilitar la identificación de biomarcadores, dichos aptámeros se pueden usar directamente para el aislamiento celular, la visualización celular y el rastreo de células in vivo . También se pueden usar para modular las actividades de los receptores celulares y administrar diferentes agentes (p. Ej., ARNip y fármacos) en las células.
Aplicaciones
Los aptámeros se pueden utilizar en:
- Reactivos de afinidad
- Sondas de bioimagen
- Detección [50] [51] [52] [53]
- Terapéuticos, por ejemplo, pegaptanib .
- Liberación controlada de terapéuticos
- Diagnóstico clínico y ambiental [1]
Los aptámeros también han sido contra varios patógenos tanto bacterianos [54] como virus, incluidos los virus de la influenza A y B, [55] virus sincitial respiratorio (RSV) [55] y coronavirus del SARS (SARS-CoV) [55] en varios entornos experimentales.
Reemplazo de anticuerpos
Los aptámeros tienen una capacidad innata para unirse a cualquier molécula a la que se dirijan, incluidas las células cancerosas y las bacterias . Unidos a un objetivo, los aptámeros inhiben su actividad. Los aptámeros padecen dos problemas que limitan su eficacia. En primer lugar, los enlaces que forman con las moléculas objetivo suelen ser demasiado débiles para ser eficaces, [ cita requerida ] y, en segundo lugar, las enzimas los digieren fácilmente .
Agregar una base no natural a un aptámero estándar puede aumentar su capacidad de unirse a las moléculas objetivo. Una segunda adición en forma de "ADN en mini horquilla" le da al aptámero una estructura estable y compacta que es resistente a la digestión, extendiendo su vida de horas a días. [ cita requerida ]
Es menos probable que los aptámeros provoquen respuestas inmunitarias indeseables que los anticuerpos . [ cita requerida ]
Liberación controlada de terapéuticos
La capacidad de los aptámeros para unirse de forma reversible a moléculas como las proteínas ha generado un interés creciente en su uso para facilitar la liberación controlada de biomoléculas terapéuticas, como los factores de crecimiento . Esto se puede lograr ajustando la fuerza de afinidad para liberar pasivamente los factores de crecimiento, [56] junto con la liberación activa a través de mecanismos como la hibridación del aptámero con oligonucleótidos complementarios [57] o el despliegue del aptámero debido a las fuerzas de tracción celular. [58]
PCR
Los aptámeros se han utilizado para crear funciones de inicio en caliente en enzimas de PCR para evitar la amplificación no específica durante la configuración y las fases iniciales de las reacciones de PCR . [59]
Ver también
- Aptámeros antitrombina
- Desoxirribozima
- Anticuerpo sintético
- Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial
- Jack W. Szostak
- Gerald Joyce
- Ronald Breaker
- Pegaptanib
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