La ultracentrifugación analítica es una técnica analítica que combina una ultracentrífuga con sistemas de monitorización óptica.
En una ultracentrífuga analítica (comúnmente abreviada como AUC), el perfil de sedimentación de una muestra es monitoreado en tiempo real por un sistema de detección óptica. La muestra se detecta mediante absorción de luz ultravioleta y / o sistema sensible al índice de refracción óptico de interferencia, monitoreado por una matriz de diodos sensibles a la luz o por película en las máquinas más antiguas. De este modo, el operador puede observar el cambio de la concentración de la muestra frente al eje del perfil de rotación con el tiempo como resultado del campo centrífugo aplicado. Con la instrumentación moderna, estas observaciones se digitalizan electrónicamente y se almacenan para su posterior análisis matemático.
La información que se puede obtener de una ultracentrífuga analítica incluye la forma bruta de las macromoléculas , los cambios conformacionales en las macromoléculas y las distribuciones de tamaño de las macromoléculas. Con AUC es posible obtener información sobre el número y estequiometría de subunidades de complejos no covalentes y constantes constantes de equilibrio de macromoléculas como proteínas , ADN , nanopartículas u otros ensamblajes de diferentes clases de moléculas. La medida más sencilla que se puede obtener es el coeficiente de sedimentación , que depende del tamaño de las moléculas sedimentadas. Esta es la relación entre la velocidad de sedimentación de una partícula y la aceleración aplicada que causa la sedimentación.
La ultracentrifugación analítica ha experimentado un aumento en su uso recientemente debido a la mayor facilidad de análisis con las computadoras modernas y al desarrollo de software, incluido un paquete de software respaldado por los Institutos Nacionales de Salud , SedFit.
Historia
Instrumentación
Una ultracentrífuga analítica tiene una fuente de luz y detectores ópticos. Para permitir que la luz pase a través del analito durante la ejecución de la ultracentrífuga, se requieren células especializadas que deben cumplir con altos estándares ópticos y resistir las fuerzas centrífugas. Cada celda consta de una carcasa, dos ventanas de vidrio de cuarzo ópticamente puro y una pieza central con uno o dos sectores y orificios de llenado para el sector o sectores, cerrados con un tapón de rosca en la carcasa. Estas celdas se colocan en una cavidad de rotor con un orificio continuo, con un collar en la parte inferior para retener la celda.
Teoría
Tipos de experimentos
Aplicando equipos específicos y adaptando los parámetros de medición se pueden realizar varios tipos de experimentos. Los experimentos de AUC más comunes son los experimentos de velocidad de sedimentación y de equilibrio de sedimentación.
Velocidad de sedimentación
Los experimentos de velocidad de sedimentación muestran la forma y la masa molar de los analitos, así como su distribución de tamaño. [2] La resolución de tamaño de este método se escala aproximadamente con el cuadrado de los radios de las partículas, y ajustando la velocidad del rotor del experimento se pueden cubrir rangos de tamaño de 100 Da a 10 GDa. Los experimentos de velocidad de sedimentación también se pueden utilizar para estudiar los equilibrios químicos reversibles entre especies macromoleculares, ya sea controlando el número y la masa molar de los complejos macromoleculares, obteniendo información sobre la composición del complejo a partir del análisis de múltiples señales aprovechando las diferencias en cada componente de la señal espectroscópica, o mediante siguiendo la dependencia de la composición de las velocidades de sedimentación del sistema macromolecular, como se describe en la teoría de Gilbert-Jenkins .
El experimento tiene como objetivo monitorear el comportamiento de la sedimentación a una velocidad angular fija.
Equilibrio de sedimentación
Los experimentos de equilibrio de sedimentación informan sobre la masa molar de los analitos y sobre las constantes de equilibrio químico . [3]
Se preocupan por ajustar la velocidad del rotor de manera que se forme un perfil de concentración de estado estacionario c (r) de la muestra en la celda, donde la sedimentación y la difusión se anulan entre sí.
Centrifugación en gradiente de densidad
Evaluación de datos
Ver también
Referencias
- ^ "Manual técnico, Ultracentrífuga Spinco modelo E" . Colecciones digitales del Instituto de Historia de la Ciencia . Consultado el 18 de diciembre de 2018 .
- ^ Perez-Ramirez, B. y Steckert, JJ (2005). Proteínas terapéuticas: métodos y protocolos. CM Smales y DC James, Eds. Volumen 308: 301-318. Humana Press Inc, Totowa, Nueva Jersey.
- ^ Ghirlando, R. (2011). "El análisis de interacciones macromoleculares por equilibrio de sedimentación" . Ultracentrifugación analítica moderna: métodos . 58 (1): 145-156. doi : 10.1016 / j.ymeth.2010.12.005 . PMC 3090454 . PMID 21167941 .
enlaces externos
Otras lecturas
- Lebowitz J, Lewis MS, Schuck P (enero de 2005). "Ultracentrifugación analítica moderna en la ciencia de las proteínas: una revisión tutorial" . Ciencia de las proteínas . 102 (9): 2067–2069. doi : 10.1110 / ps.0207702 . PMC 2373601 . PMID 12192063 .
- Balbo A, Minor KH, Velikovsky CA, Mariuzza RA, Peterson CB, Schuck P (enero de 2005). "Estudio de complejos multiproteicos mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación multiseñal" . PNAS . 102 (1): 81–86. Código bibliográfico : 2005PNAS..102 ... 81B . doi : 10.1073 / pnas.0408399102 . PMC 538923 . PMID 15613487 .
- Cole J, Hansen J (diciembre de 1999). "Ultracentrifugación analítica como herramienta de investigación biomolecular contemporánea" . J Biomol Tech . 10 (4): 163–76. PMC 2291609 . PMID 19499023 .