Aspartato carbamoiltransferasa
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Aspartato carbamoiltransferasa
Apartato-carbamoiltransferasa-pdb-2ATC.png
Aspartato carbamoiltransferasa de Escherichia coli . PDB 2ATC.
Identificadores
CE no.2.1.3.2
No CAS.9012-49-1
Bases de datos
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BRENDAEntrada BRENDA
FÁCILNiceZyme vista
KEGGEntrada KEGG
MetaCyccamino metabólico
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NCBIproteinas
Carbamoilfosfato sintetasa 2 humana, aspartato transcarbamoilasa, dihidroorotasa
Identificadores
SímboloCANALLA
Gen NCBI790
HGNC1424
OMIM114010
RefSeqNM_004341
UniProtP27708
Otros datos
Número CE2.1.3.2
LugarChr. 2 p22-p21
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EstructurasModelo suizo
DominiosInterPro

La aspartato carbamoiltransferasa (también conocida como aspartato transcarbamoilasa o ATCasa ) cataliza el primer paso en la ruta biosintética de pirimidina ( EC 2.1.3.2 ). [1]

En E. coli , la enzima es un complejo proteico de múltiples subunidades compuesto por 12 subunidades (300 kDa en total). [2] La composición de las subunidades es C 6 R 6 , formando 2 trímeros de subunidades catalíticas (34 kDa) y 3 dímeros de subunidades reguladoras (17 kDa). La disposición particular de las subunidades catalíticas y reguladoras en esta enzima confiere al complejo un comportamiento fuertemente alostérico con respecto a sus sustratos. [3] La enzima es un ejemplo arquetípico de modulación alostérica del control fino de las reacciones enzimáticas metabólicas.

ATCase no sigue la cinética de Michaelis-Menten . En cambio, se encuentra entre sus estados "tensos" de baja actividad y baja afinidad y sus estados "relajados" de alta actividad y alta afinidad. [4] La unión del sustrato a las subunidades catalíticas da como resultado un cambio de equilibrio hacia el estado R, mientras que la unión de CTP a las subunidades reguladoras da como resultado un cambio de equilibrio hacia el estado T. La unión de ATP a las subunidades reguladoras da como resultado un cambio de equilibrio hacia el estado R. [5]

Reacción

ATCase es una enzima altamente regulada que cataliza el primer paso comprometido en la biosíntesis de pirimidina, la condensación de l-aspartato y carbamoil fosfato para formar N-carbamil-L-aspartato y fosfato inorgánico . La catálisis por ATCasa sirve como el paso limitante de la velocidad en la biosíntesis de pirimidina porque altera su velocidad catalítica en respuesta a los niveles celulares de pirimidinas y purinas . El producto final de la vía de la pirimidina, CTP , disminuye la velocidad catalítica, mientras que el ATP , el producto final de la vía paralela de las purinas, aumenta la velocidad catalítica.

Estructura

Diagrama esquemático de la estructura de la ATCase, que muestra la disposición espacial de las subunidades reguladoras verdes (R) y catalíticas azules (C). Rediseñado y modificado de Ke et al. , 1984. [6]

La discusión de la estructura, centro catalítico, y el sitio alostérico que sigue se basa en la versión procariota de ATCasa, específicamente E. coli ' s.

Los primeros estudios demostraron que ATCase consta de dos tipos diferentes de cadenas polipeptídicas , que tienen diferentes funciones. [7] Las subunidades catalíticas catalizan la carbamilación del grupo amino del aspartato pero no tienen propiedades reguladoras, mientras que las subunidades reguladoras no tienen ninguna actividad catalítica pero contienen los sitios reguladores para la unión del efector. La holoenzima ATCase está compuesta por dos trímeros catalíticos que están en contacto y se mantienen unidos por tres dímeros reguladores, por lo que la forma nativa de la enzima contiene seis cadenas de cada tipo, con un peso molecular total de 310 kDa .

Cada uno de los dominios catalíticos está compuesto por dos dominios estructurales, el dominio aspartato, que contiene la mayoría de los residuos responsables de la unión del aspartato , y el dominio carbamoil fosfato, que contiene la mayoría de los residuos que se unen al carbamoil fosfato . Cada dominio regulador también se compone de dos dominios, el dominio alostérico, que tiene el sitio de unión para los efectores de nucleótidos , y el dominio de zinc , que consta de cuatro residuos de cisteína agrupados en su región C-terminal. Estos residuos coordinan un átomo de zinc que no está involucrado en ninguna propiedad catalítica, pero se ha demostrado que es esencial para la asociación de subunidades reguladoras y catalíticas. [8]

La disposición tridimensional de las subunidades catalíticas y reguladoras implica varios contactos estabilizadores iónicos e hidrófobos entre los residuos de aminoácidos. [6] Cada cadena catalítica está en contacto con otras tres cadenas catalíticas y dos cadenas reguladoras. Cada monómero regulador está en contacto con otra cadena reguladora y dos cadenas catalíticas. En la enzima no ligada, los dos trímeros catalíticos también están en contacto.

Centro catalítico

El sitio catalítico de ATCasa está ubicado en la interfaz entre dos cadenas catalíticas vecinas en el mismo trímero e incorpora cadenas laterales de aminoácidos de ambas subunidades. La comprensión del modo de unión de los sustratos al centro catalítico de la ATCasa fue posible en primer lugar mediante la unión de un análogo de bisustrato, N- (fosfonoacetil) -L-aspartato (PALA). [9] Este compuesto es un fuerte inhibidor de la ATCasa y tiene una estructura que se cree que es muy cercana a la del estado de transición de los sustratos. [10] Además, se han obtenido estructuras cristalinas de ATCasa unidas a carbamoilfosfato y succinato. [11]Estos estudios, además de las investigaciones que utilizan mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos específicos, han identificado varios residuos que son cruciales para la catálisis, como Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231 y Ser80 y Lys84 de una cadena catalítica adyacente. El sitio activo es un bolsillo con una carga muy positiva. Una de las cadenas laterales más críticas es la de Arg54, que interactúa con un oxígeno terminal y el oxígeno anhídrido del carbamoilfosfato, estabilizando la carga negativa del grupo fosfato saliente. Arg105, His134 y Thr55 ayudan a aumentar la electrofilia del carbono carbonilo al interactuar con el oxígeno del carbonilo. [7] En general, la mejora de la velocidad de la ATCasa se logra mediante la orientación y estabilización de sustratos, intermedios y productos en lugar de la participación directa de residuos de aminoácidos en el mecanismo catalítico.

Sitio alostérico

El sitio alostérico en el dominio alostérico de las cadenas R del complejo ATCasa se une a los nucleótidos ATP, CTP y / o UTP. Hay un sitio con alta afinidad por ATP y CTP y uno con una afinidad de 10 a 20 veces menor por estos nucleótidos en cada dímero regulador. [7] El ATP se une predominantemente a los sitios de alta afinidad y posteriormente activa la enzima, mientras que la unión de UTP y CTP conduce a la inhibición de la actividad. UTP puede unirse al sitio alostérico, pero la inhibición de ATCasa por UTP solo es posible en combinación con CTP. Con CTP presente, la unión de UTP se mejora y se dirige preferentemente a los sitios de baja afinidad. Por el contrario, la unión de UTP conduce a una mayor afinidad por CTP en los sitios de alta afinidad y juntos inhiben la actividad enzimática hasta en un 95%, mientras que la unión de CTP por sí sola inhibe la actividad de 50% a 70%. [3]La comparación de las estructuras cristalinas de las formas T y R de ATCasa muestra que aumenta de tamaño durante la transición alostérica y que las subunidades catalíticas se condensan durante este proceso. Los dos trímeros catalíticos se separan a lo largo del eje triple en 12 Å y giran alrededor de este eje en 5 ° cada uno, lo que finalmente conduce a una reorientación de las subunidades reguladoras alrededor de su eje doble en 15 °. [12] Este cambio de estructura cuaternaria está asociado con alteraciones en las interacciones entre subunidades y entre dominios. La interacción entre las subunidades C1-C4 y R1 se modifica ampliamente durante esta conversión. En particular, hay un gran movimiento de los residuos de aminoácidos 230-254, conocidos colectivamente como bucle 240s. Estos residuos se encuentran en la hendidura entre eldominios de carbamoil fosfato y aspartato en la interfaz C1-C4. El resultado general de estos cambios estructurales es que los dos dominios de cada cadena catalítica se acercan, asegurando un mejor contacto con los sustratos o sus análogos .

Durante esta transición estructural, se pierden algunas interacciones entre cadenas laterales y se establecen otras. Los estudios han confirmado que la posición del bucle 240s afecta directamente a la unión del sustrato en el sitio activo correspondiente. [13] Estudios anteriores que utilizaron mutagénesis dirigida al sitio del bucle 240s mostraron que las interacciones entre Asp271 y Tyr240, y entre Glu239 de C1 y Tyr165 de C4 estabilizarían el estado T, mientras que las interacciones entre Glu239 de C1 y Lys164 y Tyr165 de C4 estabilizaría el estado R. [14]

Ubicada cerca del bucle 240s y el sitio activo, la región del bucle que abarca los residuos 160-166 desempeña un papel tanto en la arquitectura interna de la enzima como en sus propiedades reguladoras. [15] En particular, el residuo Asp162 interactúa con Gln231 (conocido por estar involucrado en la unión de aspartato) y se une a los mismos residuos en los estados T y R. Un mutante que tenía este residuo mutado a alanina mostró una enorme reducción en la actividad específica, una disminución del doble en la afinidad por el aspartato , una pérdida de cooperatividad homotrópica y una disminución de la activación por ATP.. Se sugirió que el cambio en la estructura general causado por la introducción de este residuo afecta a otros residuos en las interfaces R1-C1, R1-C4 y C1-C4, que están involucrados en la transición de la estructura cuaternaria . [dieciséis]

Montaje del complejo

Las subunidades reguladoras y catalíticas existen como homólogos de proteínas fusionadas, lo que proporciona una fuerte evidencia de que interactuarían juntas. [17] Dos trímeros catalíticos y dos dímeros reguladores se ensamblan para formar un intermedio de aspartato carbamoiltransferasa que consta de 6 subunidades catalíticas y 4 subunidades reguladoras. [18]

Referencias

  1. ^ Simmer JP, Kelly RE, Rinker AG, Zimmermann BH, Scully JL, Kim H, Evans DR (enero de 1990). "Dihidroorotasa de mamífero: secuencia de nucleótidos, secuencias de péptidos y evolución del dominio de dihidroorotasa de la proteína multifuncional CAD" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 87 (1): 174–8. doi : 10.1073 / pnas.87.1.174 . PMC  53223 . PMID  1967494 .
  2. ^ Macol CP, Tsuruta H, Stec B, Kantrowitz ER (mayo de 2001). "Evidencia estructural directa para una transición alostérica concertada en Escherichia coli aspartato transcarbamoilasa". Biología estructural de la naturaleza . 8 (5): 423–6. doi : 10.1038 / 87582 . PMID 11323717 . S2CID 35403933 .  
  3. ↑ a b Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH (septiembre de 2001). "Regulación alostérica de la actividad catalítica: Escherichia coli aspartato transcarbamoilasa versus corismato mutasa de levadura" . Revisiones de Microbiología y Biología Molecular . 65 (3): 404–21, índice. doi : 10.1128 / MMBR.65.3.404-421.2001 . PMC 99034 . PMID 11528003 .  
  4. ^ Bioquímica, por Campbell y Farrel, Capítulo 7
  5. ^ Alberts, Bruce, autor. Biología molecular de la célula . ISBN 978-1-315-73536-8. OCLC  1082214404 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  6. ↑ a b Ke HM, Honzatko RB, Lipscomb WN (julio de 1984). "Estructura de la carbamoiltransferasa de aspartato no ligada de Escherichia coli a una resolución de 2,6 Å" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 81 (13): 4037–40. doi : 10.1073 / pnas.81.13.4037 . PMC 345363 . PMID 6377306 .  
  7. ↑ a b c Lipscomb WN (1994). "Aspartato transcarbamilasa de Escherichia coli: actividad y regulación". Avances en enzimología y áreas afines de la biología molecular . Avances en enzimología y áreas relacionadas de la biología molecular. 68 . págs. 67-151. doi : 10.1002 / 9780470123140.ch3 . ISBN 9780470123140. PMID  8154326 .
  8. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (agosto de 1988). "Escherichia coli aspartato transcarbamilasa: la relación entre estructura y función". Ciencia . 241 (4866): 669–74. doi : 10.1126 / science.3041592 . PMID 3041592 . 
  9. ^ Krause KL, Volz KW, Lipscomb WN (febrero de 1987). "2.5 Una estructura de aspartato carbamoiltransferasa complejada con el análogo bisustrato N- (fosfonacetil) -L-aspartato". Revista de Biología Molecular . 193 (3): 527–53. doi : 10.1016 / 0022-2836 (87) 90265-8 . PMID 3586030 . 
  10. ^ Wang J, Stieglitz KA, Cardia JP, Kantrowitz ER (junio de 2005). "Base estructural para la unión ordenada de sustrato y cooperatividad en aspartato transcarbamoilasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 102 (25): 8881–6. doi : 10.1073 / pnas.0503742102 . PMC 1157055 . PMID 15951418 .  
  11. ^ Gouaux JE, Lipscomb WN (junio de 1988). "Estructura tridimensional de carbamoil fosfato y succinato unido a aspartato carbamoiltransferasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 85 (12): 4205–8. doi : 10.1073 / pnas.85.12.4205 . PMC 280395 . PMID 3380787 .  
  12. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (febrero de 1990). "Escherichia coli aspartato transcarbamoilasa: la base molecular para una transición alostérica concertada". Tendencias en Ciencias Bioquímicas . 15 (2): 53–9. doi : 10.1016 / 0968-0004 (90) 90176-C . PMID 2186515 . 
  13. ^ Fetler L, Vachette P, Hervé G, Ladjimi MM (diciembre de 1995). "A diferencia de la transición de la estructura cuaternaria, el cambio de la estructura terciaria del bucle 240s en la transcarbamilasa de aspartato alostérico requiere la saturación del sitio activo por el sustrato para completarse". Bioquímica . 34 (48): 15654–60. doi : 10.1021 / bi00048a008 . PMID 7495794 . 
  14. ^ Middleton SA, Kantrowitz ER (agosto de 1986). "Importancia del bucle en los residuos 230-245 en las interacciones alostéricas de Escherichia coli aspartato carbamoiltransferasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 83 (16): 5866–70. doi : 10.1073 / pnas.83.16.5866 . PMC 386397 . PMID 3526342 .  
  15. ^ Newton CJ, Stevens RC, Kantrowitz ER (marzo de 1992). "Importancia de un residuo conservado, aspartato-162, para la función de Escherichia coli aspartato transcarbamoilasa". Bioquímica . 31 (11): 3026–32. doi : 10.1021 / bi00126a026 . PMID 1550826 . 
  16. ^ Fetler L, Tauc P, Baker DP, Macol CP, Kantrowitz ER, Vachette P (mayo de 2002). "El reemplazo de Asp-162 por Ala evita la transición cooperativa de los sustratos al tiempo que mejora el efecto del activador alostérico ATP sobre la aspartato transcarbamoilasa de E. coli" . Ciencia de las proteínas . 11 (5): 1074–81. doi : 10.1110 / ps.4500102 . PMC 2373563 . PMID 11967364 .  
  17. ^ Marsh JA, Hernández H, Hall Z, Ahnert SE, Perica T, Robinson CV, Teichmann SA (abril de 2013). "Los complejos de proteínas están bajo selección evolutiva para ensamblar a través de vías ordenadas" . Celular . 153 (2): 461–470. doi : 10.1016 / j.cell.2013.02.044 . PMC 4009401 . PMID 23582331 .  
  18. ^ Evans DR, Pastra-Landis SC, Lipscomb WN (abril de 1974). "Un complejo intermedio en la disociación de aspartato transcarbamilasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 71 (4): 1351–5. doi : 10.1073 / pnas.71.4.1351 . PMC 388226 . PMID 4598300 .  

enlaces externos

  • Aspartato + carbamoiltransferasa en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
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