enzimas tipo BBE
Las enzimas similares al puente de berberina (enzimas similares a BBE ) forman un subgrupo de la superfamilia de oxidasas ligadas a FAD (SCOPe d.58.32), estructuralmente caracterizadas por un pliegue típico observado inicialmente para la oxidasa de alcohol de vanililo (VAO). [1] Estas proteínas son parte de una familia multigénica (PF08031) que se puede encontrar en plantas, hongos y bacterias. [2]
La familia de enzimas tipo BBE forma un gran subgrupo que tiene un elemento estructural C-terminal especial adyacente a la región de unión al sustrato. Un homónimo de esta familia es la (S)-reticulina oxidasa o enzima puente berberina de la amapola de California ( Eschscholzia californica ), la responsable de catalizar la conversión de (S)-reticulina a (S)-scoulerina. Esta conversión se realiza mediante una reacción de cierre del anillo oxidativo. El producto de esta reacción es el enlace CC y se denomina puente de berberina. Además, marca un punto de ramificación en la biosíntesis de alcaloides de bencilisoquinolina.
Como se mencionó anteriormente, las enzimas similares a BBE se encuentran en la gran familia de oxidasas ligadas a FAD . En cuanto a la estructura de esta familia en particular, tienen un módulo de unión a FAD formado por las partes N- y C-terminal de la proteína. Hay un módulo de unión al sustrato que, en colaboración con el anillo de isoaloxazina de FAD, dispone el entorno para una unión y oxidación eficientes del sustrato . [3]
Los cultivos celulares de Berberis beaniana ( B. beaniana ), que en este experimento se toman como ejemplo, se recolectaron entre 10 y 12 días y contenían grandes cantidades de protoberberinas, principalmente jatrorrizina . Estos alcaloides cuaternarios tienen un fuerte efecto inhibitorio sobre el BBE, por lo que tuvieron que ser eliminados. Con el fin de eliminar la mayoría de estas sustancias catiónicas que interfieren, la solución enzimática se trató primero con carboximetil-Sepharose y posteriormente con carbón dextracubierto.
Después de eso, la solución resultante se fraccionó utilizando procedimientos estándar y generó, después de enfoque isoeléctrico, una sola banda de proteína en electroforesis en gel SDS. Al final, la enzima obtenida había sido purificada 450 veces y contenía un 0,7% de la actividad presente en el extracto crudo al inicio. [4]
El pH óptimo de la enzima tipo BBE es de 8,9, esto quiere decir que trabaja en medio alcalino, pero el punto isoeléctrico de la enzima homogénea se encuentra en pH 4,9, que es un medio bastante ácido. Este valor se obtuvo con técnicas de enfoque isoeléctrico y cromatoenfoque .
