El enfoque isoeléctrico ( IEF ), también conocido como electroenfoque , es una técnica para separar diferentes moléculas por diferencias en su punto isoeléctrico (pI). [1] [2] Es un tipo de electroforesis de zona que generalmente se realiza en proteínas en un gel que aprovecha el hecho de que la carga general de la molécula de interés es una función del pH de su entorno.
Procedimiento
IEF implica la adición de una solución anfolito en geles de gradiente de pH inmovilizado (IPG). Los IPG son la matriz de gel de acrilamida copolimerizada con el gradiente de pH, lo que da como resultado gradientes completamente estables, excepto los valores de pH más alcalinos (> 12). El gradiente de pH inmovilizado se obtiene mediante el cambio continuo en la proporción de inmovilinas . Una inmovilina es un ácido o base débil definido por su valor de pK.
Una proteína que se encuentra en una región de pH por debajo de su punto isoeléctrico (pI) se cargará positivamente y, por lo tanto, migrará hacia el cátodo (electrodo con carga negativa). Sin embargo, a medida que migra a través de un gradiente de pH creciente, la carga total de la proteína disminuirá hasta que la proteína alcance la región de pH que corresponde a su pI. En este punto, no tiene carga neta y, por lo tanto, cesa la migración (ya que no hay atracción eléctrica hacia ninguno de los electrodos). Como resultado, las proteínas se enfocan en bandas estacionarias definidas con cada proteína colocada en un punto en el gradiente de pH correspondiente a su pI. La técnica es capaz de una resolución extremadamente alta con proteínas que se diferencian por una sola carga fraccionada en bandas separadas.
Las moléculas a enfocar se distribuyen en un medio que tiene un gradiente de pH (generalmente creado por anfolitos alifáticos ). Una corriente eléctrica pasa a través del medio, creando un ánodo "positivo" y un extremo de cátodo "negativo" . Las moléculas cargadas negativamente migran a través del gradiente de pH en el medio hacia el extremo "positivo" mientras que las moléculas cargadas positivamente se mueven hacia el extremo "negativo". Cuando una partícula se mueve hacia el polo opuesto a su carga, se mueve a través del gradiente de pH cambiante hasta que alcanza un punto en el que se alcanza el punto isoeléctrico del pH de esas moléculas. En este punto, la molécula ya no tiene una carga eléctrica neta (debido a la protonación o desprotonación de los grupos funcionales asociados) y, como tal, no avanzará más dentro del gel. El gradiente se establece antes de añadir las partículas de interés sometiendo primero a electroforesis una solución de moléculas pequeñas como polianfolitos con valores de pI variables.
El método se aplica con especial frecuencia en el estudio de proteínas , que se separan en función de su contenido relativo de residuos ácidos y básicos , cuyo valor está representado por el pI. Las proteínas se introducen en un gel de gradiente de pH inmovilizado compuesto de poliacrilamida , almidón o agarosa donde se ha establecido un gradiente de pH. Los geles con poros grandes se utilizan generalmente en este proceso para eliminar cualquier efecto de "tamizado" o artefactos en el pI causados por diferentes tasas de migración para proteínas de diferentes tamaños. El enfoque isoeléctrico puede resolver proteínas que difieren en el valor de pI en tan solo 0,01. [3] El enfoque isoeléctrico es el primer paso en la electroforesis en gel bidimensional , en la que las proteínas se separan primero por su valor pI y luego se separan por peso molecular mediante SDS-PAGE .
Células vivas
Según algunas opiniones, [4] [5] que viven eucariotas células realizar el enfoque isoeléctrico de las proteínas en su interior para superar una limitación de la velocidad de reacción metabólica por difusión de enzimas y sus reactivos, y para regular la velocidad de determinados procesos bioquímicos. Al concentrar las enzimas de vías metabólicas particulares en regiones distintas y pequeñas de su interior, la célula puede aumentar la tasa de vías bioquímicas particulares en varios órdenes de magnitud. Mediante la modificación del punto isoeléctrico (pI) de moléculas de una enzima mediante, por ejemplo, fosforilación o desfosforilación, la célula puede transferir moléculas de la enzima entre diferentes partes de su interior, para activar o desactivar procesos bioquímicos particulares.
A base de chips de microfluidos
La electroforesis basada en microchip es una alternativa prometedora a la electroforesis capilar, ya que tiene el potencial de proporcionar un análisis rápido de proteínas, una integración sencilla con otras operaciones unitarias de microfluidos, detección de canales completos, películas de nitrocelulosa, tamaños de muestra más pequeños y costos de fabricación más bajos.
Multiunión
La mayor demanda de herramientas de separación de proteínas más rápidas y fáciles de usar ha acelerado la evolución de IEF hacia separaciones en solución. En este contexto, se desarrolló un sistema IEF de múltiples uniones para realizar separaciones IEF rápidas y sin gel. El sistema IEF de múltiples uniones utiliza una serie de vasos con un capilar que pasa a través de cada vaso. [6] Parte del capilar de cada vaso se reemplaza por una membrana semipermeable. Los recipientes contienen soluciones tampón con diferentes valores de pH, de modo que se establece eficazmente un gradiente de pH dentro del capilar. La solución tampón en cada recipiente tiene un contacto eléctrico con un divisor de voltaje conectado a una fuente de alimentación de alto voltaje, que establece un campo eléctrico a lo largo del capilar. Cuando se inyecta una muestra (una mezcla de péptidos o proteínas) en el capilar, la presencia del campo eléctrico y el gradiente de pH separa estas moléculas según sus puntos isoeléctricos. El sistema IEF de unión múltiple se ha utilizado para separar mezclas de péptidos trípticos para proteómica bidimensional [7] y proteínas del plasma sanguíneo de pacientes con enfermedad de Alzheimer para el descubrimiento de biomarcadores. [6]
Referencias
- ^ Bjellqvist, Bengt; Ek, Kristina; Giorgio Righetti, muelle; Gianazza, Elisabetta; Görg, Angelika; Westermeier, Reiner; Postel, Wilhelm (1982). "Enfoque isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados: Principio, metodología y algunas aplicaciones". Revista de métodos bioquímicos y biofísicos . 6 (4): 317–339. doi : 10.1016 / 0165-022X (82) 90013-6 . ISSN 0165-022X . PMID 7142660 .
- ^ Pier Giorgio Righetti (1 de abril de 2000). Enfoque isoeléctrico: teoría, metodología y aplicación . Elsevier. ISBN 978-0-08-085880-7.
- ^ Stryer, Lubert: "Biochemie", página 50. Spektrum Akademischer Verlag, 1996 (alemán)
- ^ Flegr J (1990). "¿Una célula realiza un enfoque isoeléctrico?" (PDF) . BioSystems . 24 (2): 127-133. doi : 10.1016 / 0303-2647 (90) 90005-L . PMID 2249006 .
- ^ Baskin EF; Bukshpan S; Zilberstein GV (2006). "Transporte de proteínas intracelulares inducido por pH". Biología física . 3 (2): 101–106. doi : 10.1088 / 1478-3975 / 3/2/002 . PMID 16829696 .
- ^ a b Pirmoradian M .; Astorga-Wells, J., Zubarev, RA. (2015). "Dispositivo de enfoque isoeléctrico capilar multifunción combinado con un intercambiador de tampón asistido por membrana en línea permite el fraccionamiento puntual isoeléctrico de proteínas plasmáticas humanas intactas para el descubrimiento de biomarcadores" (PDF) . Química analítica . 87 (23): 11840-11846. doi : 10.1021 / acs.analchem.5b03344 . hdl : 10616/44920 . PMID 26531800 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Pirmoradian, M .; Zhang, B .; Chingin, K .; Astorga-Wells, J .; Zubarev RA (2014). "Dispositivo de enfoque isoeléctrico asistido por membrana como un fraccionador micro-preparativo para proteómica bidimensional de escopeta". Química analítica . 86 (12): 5728–5732. doi : 10.1021 / ac404180e . PMID 24824042 .