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La biología química es una disciplina científica que abarca los campos de la química y la biología . La disciplina implica la aplicación de técnicas químicas, análisis y, a menudo, pequeñas moléculas producidas a través de la química sintética , al estudio y manipulación de sistemas biológicos. A diferencia de la bioquímica , que implica el estudio de la química de las biomoléculas y la regulación de las vías bioquímicas dentro y entre las células, la biología química se ocupa de la química aplicada a la biología (síntesis de biomoléculas, simulación de sistemas biológicos, etc.).

Introducción [ editar ]

Algunas formas de biología química intentan responder preguntas biológicas sondeando directamente los sistemas vivos a nivel químico. A diferencia de la investigación que utiliza bioquímica , genética o biología molecular , donde la mutagénesis puede proporcionar una nueva versión del organismo, célula o biomolécula de interés, la biología química prueba sistemas in vitro e in vivo con pequeñas moléculas que han sido diseñadas para un propósito o identificado sobre la base de un cribado bioquímico o basado en células (ver genética química ).

La biología química es una de varias ciencias interdisciplinarias que tienden a diferir de los campos reduccionistas más antiguos y cuyos objetivos son lograr una descripción del holismo científico . Biología química tiene raíces científicas, históricas y filosóficas en la química médica , química supramolecular , la química bioorganic , la farmacología , la genética , la bioquímica y la ingeniería metabólica .

Sistemas de interés [ editar ]

Técnicas de enriquecimiento para proteómica [ editar ]

Los biólogos químicos trabajan para mejorar la proteómica mediante el desarrollo de estrategias de enriquecimiento, etiquetas de afinidad química y nuevas sondas. Las muestras para proteómica a menudo contienen muchas secuencias de péptidos y la secuencia de interés puede estar muy representada o tener poca abundancia, lo que crea una barrera para su detección. Los métodos de biología química pueden reducir la complejidad de la muestra mediante el enriquecimiento selectivo mediante cromatografía de afinidad . Esto implica apuntar a un péptido con una característica distintiva como un marcador de biotina o una modificación postraduccional . [1] Se han desarrollado métodos que incluyen el uso de anticuerpos, lectinas para capturar glicoproteínas e iones metálicos inmovilizados. para capturar péptidos fosforilados y sustratos de enzimas para capturar enzimas seleccionadas.

Sondas enzimáticas [ editar ]

Para investigar la actividad enzimática en oposición a la proteína total, se han desarrollado reactivos basados ​​en actividad para marcar la forma enzimáticamente activa de las proteínas (ver Proteómica basada en actividad ). Por ejemplo, los inhibidores de serina hidrolasa y cisteína proteasa se han convertido en inhibidores suicidas . [2] Esta estrategia mejora la capacidad de analizar selectivamente los componentes de baja abundancia a través de la focalización directa. [3] La actividad enzimática también se puede controlar a través del sustrato convertido. [4]La identificación de sustratos enzimáticos es un problema de gran dificultad en la proteómica y es vital para la comprensión de las vías de transducción de señales en las células. Un método que se ha desarrollado utiliza quinasas "sensibles a los análogos" para marcar sustratos utilizando un análogo de ATP no natural, lo que facilita la visualización y la identificación a través de un mango único. [5]

Glicobiología [ editar ]

Si bien el ADN , el ARN y las proteínas están codificados a nivel genético, los glucanos (polímeros de azúcar) no se codifican directamente desde el genoma y hay menos herramientas disponibles para su estudio. Por tanto, la glicobiología es un área de investigación activa para los biólogos químicos. Por ejemplo, las células pueden recibir variantes sintéticas de azúcares naturales para probar su función. El grupo de investigación de Carolyn Bertozzi ha desarrollado métodos para moléculas que reaccionan en sitios específicos en la superficie de las células mediante azúcares sintéticos. [6]

Química combinatoria [ editar ]

Los biólogos químicos utilizaron la síntesis automatizada de diversas bibliotecas de moléculas pequeñas para realizar análisis de alto rendimiento de procesos biológicos. Estos experimentos pueden conducir al descubrimiento de pequeñas moléculas con propiedades antibióticas o quimioterapéuticas. Estos enfoques de la química combinatoria son idénticos a los empleados en la disciplina de la farmacología.

Empleando biología [ editar ]

Muchos programas de investigación también se centran en el empleo de biomoléculas naturales para realizar tareas biológicas o para respaldar un nuevo método químico. En este sentido, los investigadores de biología química han demostrado que el ADN puede servir como plantilla para la química sintética, las proteínas autoensambladas pueden servir como un andamio estructural para nuevos materiales y el ARN puede evolucionar in vitro para producir una nueva función catalítica. Además, las pequeñas moléculas sintéticas heterobifuncionales (de dos caras), como los dimerizadores o PROTAC, unen dos proteínas dentro de las células, lo que puede inducir sintéticamente nuevas funciones biológicas importantes, como la degradación de proteínas dirigida. [7]

Síntesis de péptidos [ editar ]

La síntesis química de proteínas es una herramienta valiosa en biología química ya que permite la introducción de aminoácidos no naturales así como la incorporación específica de residuos de " modificaciones postraduccionales " como fosforilación, glicosilación, acetilación e incluso ubiquitinación . Estas capacidades son valiosas para los biólogos químicos, ya que los aminoácidos no naturales pueden usarse para sondear y alterar la funcionalidad de las proteínas, mientras que las modificaciones postraduccionales son ampliamente conocidas por regular la estructura y la actividad de las proteínas. Aunque se han desarrollado técnicas estrictamente biológicas para lograr estos fines, la síntesis química de péptidos a menudo tiene una barrera técnica y práctica más baja para obtener pequeñas cantidades de la proteína deseada.

Para producir cadenas de polipéptidos del tamaño de una proteína a través de pequeños fragmentos de péptidos producidos por síntesis, los biólogos químicos utilizan el proceso de ligadura química nativa . [8] La ligadura química nativa implica el acoplamiento de un tioéster C-terminal y un residuo de cisteína N-terminal, lo que finalmente da como resultado la formación de un enlace amida "nativo". Otras estrategias que se han utilizado para la ligación de fragmentos de péptidos utilizando la química de transferencia de acilo introducida por primera vez con la ligación química nativa incluyen la ligación de proteínas expresadas, [9] técnicas de sulfuración / desulfuración, [10] y el uso de auxiliares de tiol eliminables. [11]La ligadura de proteína expresada permite la instalación biotecnológica de un tioéster C-terminal usando inteínas , permitiendo así el apéndice de un péptido N-terminal sintético a la porción C-terminal producida de manera recombinante. Tanto las técnicas de sulfuración / desulfuración como el uso de auxiliares de tiol eliminables implican la instalación de un resto de tiol sintético para llevar a cabo la química de ligadura química nativa estándar, seguida de la eliminación del auxiliar / tiol.

Evolución dirigida [ editar ]

Un objetivo principal de la ingeniería de proteínas es el diseño de péptidos o proteínas novedosos con una estructura y actividad química deseadas. Debido a que nuestro conocimiento de la relación entre la secuencia primaria, la estructura y la función de las proteínas es limitado, el diseño racional de nuevas proteínas con actividades de ingeniería es extremadamente desafiante. En la evolución dirigida , se pueden utilizar ciclos repetidos de diversificación genética seguidos de un proceso de cribado o selección para imitar la selección natural en el laboratorio para diseñar nuevas proteínas con una actividad deseada. [12]

Existen varios métodos para crear grandes bibliotecas de variantes de secuencia. Entre los más utilizados se encuentran someter el ADN a radiación UV o mutágenos químicos , PCR propensa a errores , codones degenerados o recombinación . [13] [14] Una vez que se crea una gran biblioteca de variantes, se utilizan técnicas de selección o cribado para encontrar mutantes con un atributo deseado. Las técnicas comunes de selección / cribado incluyen FACS , [15] presentación de ARNm , [16] presentación de fagos y compartimentación in vitro . [17] Una vez que se encuentran variantes útiles, su secuencia de ADN se amplifica y se somete a más rondas de diversificación y selección.

El desarrollo de métodos de evolución dirigida fue honrado en 2018 con la concesión del Premio Nobel de Química a Frances Arnold por la evolución de enzimas, y a George Smith y Gregory Winter por la exhibición de fagos. [18]

Reacciones bioortogonales [ editar ]

El marcado exitoso de una molécula de interés requiere la funcionalización específica de esa molécula para reaccionar quimioespecíficamente con una sonda óptica. Para que un experimento de etiquetado se considere robusto, esa funcionalización debe perturbar mínimamente el sistema. [19] Desafortunadamente, estos requisitos a menudo son difíciles de cumplir. Muchas de las reacciones normalmente disponibles para los químicos orgánicos en el laboratorio no están disponibles en los sistemas vivos. Las reacciones sensibles al agua y redox no continuarían, los reactivos propensos al ataque nucleofílico no ofrecerían quimioespecificidad y cualquier reacción con grandes barreras cinéticas no encontraría suficiente energía en el ambiente relativamente bajo de calor de una célula viva. Por lo tanto, los químicos han desarrollado recientemente un panel de química bioortogonalque proceden quimioespecíficamente, a pesar del medio de distracción de los materiales reactivos in vivo .

El acoplamiento de una sonda a una molécula de interés debe ocurrir dentro de un período de tiempo razonablemente corto; por tanto, la cinética de la reacción de acoplamiento debería ser muy favorable. La química del clic es muy adecuada para llenar este nicho, ya que las reacciones de clic son rápidas, espontáneas, selectivas y de alto rendimiento. [20] Desafortunadamente, la "reacción de clic" más famosa, una cicloadición [3 + 2] entre una azida y un alquino acíclico , es catalizada por cobre, lo que plantea un problema grave para su uso in vivo debido a la toxicidad del cobre. [21] Para evitar la necesidad de un catalizador, Carolyn R. Bertozzilaboratorio introdujo una cepa inherente en la especie de alquino mediante el uso de un alquino cíclico. En particular, la ciclooctina reacciona con moléculas azido con un vigor distintivo. [22]

El método más común de instalar reactividad bioorthogonal en una biomolécula diana es a través del etiquetado metabólico. Las células se sumergen en un medio donde el acceso a los nutrientes se limita a los análogos modificados sintéticamente de combustibles estándar como los azúcares. Como consecuencia, estas biomoléculas alteradas se incorporan a las células de la misma manera que los metabolitos no modificados. Luego, se incorpora una sonda al sistema para obtener imágenes del destino de las biomoléculas alteradas. Otros métodos de funcionalización incluyen enzimáticamente la inserción de azidas en proteínas , [23] y la síntesis de fosfolípidos conjugados a cyclooctynes. [24]

Descubrimiento de biomoléculas a través de la metagenómica [ editar ]

Los avances en las tecnologías de secuenciación modernas a finales de la década de 1990 permitieron a los científicos investigar el ADN de comunidades de organismos en sus entornos naturales ("eDNA"), sin cultivar especies individuales en el laboratorio. Este enfoque metagenómico permitió a los científicos estudiar una amplia selección de organismos que anteriormente no se caracterizaron debido en parte a una condición de crecimiento incompetente. Las fuentes de eDNA incluyen suelos , océanos, subsuperficies , fuentes termales , respiraderos hidrotermales , casquetes polares , hábitats hipersalinos y ambientes de pH extremo. [25] De las muchas aplicaciones de la metagenómica, investigadores como Jo Handelsman ,Jon Clardy y Robert M. Goodman , exploraron enfoques metagenómicos hacia el descubrimiento de moléculas biológicamente activas como los antibióticos . [26]

Descripción general de los métodos metagenómicos

Se han utilizado estrategias de cribado funcionales o de homología para identificar genes que producen pequeñas moléculas bioactivas. Los estudios metagenómicos funcionales están diseñados para buscar fenotipos específicos que estén asociados con moléculas con características específicas. Los estudios metagenómicos de homología, por otro lado, están diseñados para examinar genes para identificar secuencias conservadas que están previamente asociadas con la expresión de moléculas biológicamente activas. [27]

Los estudios metagenómicos funcionales permiten el descubrimiento de genes novedosos que codifican moléculas biológicamente activas. Estos ensayos incluyen ensayos de superposición de agar superior donde los antibióticos generan zonas de inhibición del crecimiento contra microbios de prueba, y ensayos de pH que pueden detectar cambios de pH debido a moléculas recién sintetizadas utilizando un indicador de pH en una placa de agar . [28] El cribado de expresión génica inducida por sustrato (SIGEX), un método para cribar la expresión de genes inducidos por compuestos químicos, también se ha utilizado para buscar genes con funciones específicas. [28]Los estudios metagenómicos basados ​​en homología han conducido a un rápido descubrimiento de genes que tienen secuencias homólogas como los genes previamente conocidos que son responsables de la biosíntesis de moléculas biológicamente activas. Tan pronto como se secuencian los genes, los científicos pueden comparar miles de genomas bacterianos simultáneamente. [27] La ventaja sobre los ensayos metagenómicos funcionales es que los estudios metagenómicos de homología no requieren un sistema de organismo huésped para expresar los metagenomas, por lo que este método puede ahorrar potencialmente el tiempo dedicado al análisis de genomas no funcionales. Estos también llevaron al descubrimiento de varias proteínas nuevas y moléculas pequeñas. [29] Además, un examen in silico del Global Ocean Metagenomic Survey encontró 20 nuevos lantibióticosciclasas. [30]

Quinasas [ editar ]

La modificación postraduccional de proteínas con grupos fosfato por quinasas es un paso regulador clave en todos los sistemas biológicos. Los eventos de fosforilación, ya sea la fosforilación por las proteínas quinasas o la desfosforilación por las fosfatasas , dan como resultado la activación o desactivación de las proteínas. Estos eventos tienen un impacto en la regulación de las vías fisiológicas, lo que hace que la capacidad de diseccionar y estudiar estas vías sea integral para comprender los detalles de los procesos celulares. Existe una serie de desafíos, a saber, el gran tamaño del fosfoproteoma, la naturaleza fugaz de los eventos de fosforilación y las limitaciones físicas relacionadas de las técnicas biológicas y bioquímicas clásicas, que han limitado el avance del conocimiento en esta área.[31]

Mediante el uso de moduladores de proteína quinasas de molécula pequeña, los biólogos químicos han logrado una mejor comprensión de los efectos de la fosforilación de proteínas. Por ejemplo, los inhibidores de quinasa selectivos y no selectivos, como una clase de compuestos de piridinilimidazol [32], son potentes inhibidores útiles en la disección de las vías de señalización de MAP quinasa . Estos compuestos de piridinilimidazol funcionan dirigiéndose al bolsillo de unión de ATP . Aunque este enfoque, así como los enfoques relacionados, [33] [34]con ligeras modificaciones, ha demostrado su eficacia en varios casos, estos compuestos carecen de la especificidad adecuada para aplicaciones más generales. Otra clase de compuestos, los inhibidores basados ​​en mecanismos, combina el conocimiento de la enzimología de la quinasa con motivos de inhibición previamente utilizados. Por ejemplo, un "análogo de bisustrato" inhibe la acción de la quinasa uniendo tanto el bolsillo de unión de ATP conservado como un sitio de reconocimiento de proteína / péptido en la quinasa específica. [35] Los grupos de investigación también utilizaron análogos de ATP como sondas químicas para estudiar quinasas e identificar sus sustratos. [36] [37] [38]

El desarrollo de nuevos medios químicos de la incorporación de phosphomimetic aminoácidos en proteínas ha proporcionado información importante sobre los efectos de los eventos de fosforilación. Los eventos de fosforilación se han estudiado típicamente mediante la mutación de un sitio de fosforilación identificado ( serina , treonina o tirosina ) en un aminoácido, como la alanina , que no se puede fosforilar. Sin embargo, estas técnicas tienen limitaciones y los biólogos químicos han desarrollado formas mejoradas de investigar la fosforilación de proteínas. Instalando fosfo-serina, fosfotreonina o fosfonato análogoimita en proteínas nativas, los investigadores pueden realizar estudios in vivo para investigar los efectos de la fosforilación al extender la cantidad de tiempo que ocurre un evento de fosforilación mientras se minimizan los efectos a menudo desfavorables de las mutaciones. La ligadura de proteínas expresadas ha demostrado ser técnicas exitosas para producir proteínas sintéticamente que contienen moléculas fosfomiméticas en cualquiera de sus extremos. [9] Además, los investigadores han utilizado mutagénesis de aminoácidos no naturales en sitios específicos dentro de una secuencia de péptidos. [39] [40]

Los avances en biología química también han mejorado las técnicas clásicas de formación de imágenes de la acción de las quinasas. Por ejemplo, el desarrollo de biosensores de péptidos , los péptidos que contienen fluoróforos incorporados mejoraron la resolución temporal de los ensayos de unión in vitro. [41] Una de las técnicas más útiles para estudiar la acción de la quinasa es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . Para utilizar FRET para estudios de fosforilación, las proteínas fluorescentes se acoplan tanto a un dominio de unión de fosfoaminoácido como a un péptido que puede fosforilarse. Tras la fosforilación o desfosforilación de un péptido sustrato, se produce un cambio conformacional que da como resultado un cambio en la fluorescencia. [42]FRET también se ha utilizado junto con la microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) [43] o anticuerpos conjugados con fluorescencia y citometría de flujo [44] para proporcionar resultados cuantitativos con una excelente resolución temporal y espacial.

Fluorescencia biológica [ editar ]

Los biólogos químicos a menudo estudian las funciones de las macromoléculas biológicas utilizando técnicas de fluorescencia . La ventaja de la fluorescencia frente a otras técnicas reside en su alta sensibilidad, no invasividad, detección segura y capacidad para modular la señal de fluorescencia. En los últimos años, el descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) por Roger Y. Tsien y otros, los sistemas híbridos y los puntos cuánticos han permitido evaluar la ubicación y función de las proteínas con mayor precisión. [45] Se utilizan tres tipos principales de fluoróforos: pequeños tintes orgánicos, proteínas verdes fluorescentes y puntos cuánticos.. Los tintes orgánicos pequeños suelen tener menos de 1 kDa y se han modificado para aumentar la fotoestabilidad y el brillo y reducir el autoempaque. Los puntos cuánticos tienen longitudes de onda muy nítidas, alta absortividad molar y rendimiento cuántico. Tanto los colorantes orgánicos como los colorantes cuánticos no tienen la capacidad de reconocer la proteína de interés sin la ayuda de anticuerpos, por lo que deben usar inmunomarcaje.. Las proteínas fluorescentes están codificadas genéticamente y pueden fusionarse con su proteína de interés. Otra técnica de marcado genético es el sistema biarsenical tetracisteína, que requiere la modificación de la secuencia objetivo que incluye cuatro cisteínas, que une moléculas biarsenicales permeables a la membrana, los tintes verde y rojo "FlAsH" y "ReAsH", con afinidad picomolar. Tanto las proteínas fluorescentes como la tetracisteína biarsenical pueden expresarse en células vivas, pero presentan limitaciones importantes en la expresión ectópica y pueden causar una pérdida de función.

Se han utilizado técnicas fluorescentes para evaluar una serie de dinámicas de proteínas, incluido el seguimiento de proteínas, cambios conformacionales, interacciones proteína-proteína, síntesis y recambio de proteínas y actividad enzimática, entre otros. Tres enfoques generales para medir la redistribución y difusión netas de proteínas son el seguimiento de una sola partícula y la espectroscopia de correlacióny métodos de fotomarcaje. En el seguimiento de una sola partícula, la molécula individual debe ser lo suficientemente brillante y escasa como para ser rastreada de un video a otro. La espectroscopia de correlación analiza las fluctuaciones de intensidad que resultan de la migración de objetos fluorescentes hacia y desde un pequeño volumen en el foco de un láser. En el fotomarcaje, una proteína fluorescente puede desactivarse en un área subcelular con el uso de iluminación local intensa y el destino de la molécula marcada se puede visualizar directamente. Michalet y sus colaboradores utilizaron puntos cuánticos para el seguimiento de una sola partícula utilizando puntos cuánticos de biotina en células HeLa. [46] Una de las mejores formas de detectar cambios conformacionales en las proteínas es etiquetar la proteína de interés con dos fluoróforos muy próximos. PREOCUPARSEresponderá a los cambios conformacionales internos que resulten de la reorientación de un fluoróforo con respecto al otro. También se puede utilizar la fluorescencia para visualizar la actividad enzimática, normalmente mediante el uso de una proteómica basada en actividad inactivada (qABP). La unión covalente de una qABP al sitio activo de la enzima diana proporcionará evidencia directa sobre si la enzima es responsable de la señal tras la liberación del inhibidor y la recuperación de la fluorescencia. [47]

Ver también [ editar ]

  • Genética química
  • Quimiogenómica

Referencias [ editar ]

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Lectura adicional [ editar ]

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Revistas [ editar ]

  • ACS Chemical Biology : la nueva revista de Biología Química de la American Chemical Society.
  • Química bioorgánica y medicinal - The Tetrahedron Journal for Research at the Interface of Chemistry and Biology
  • ChemBioChem : una revista europea de biología química
  • Biología química : un punto de acceso a las noticias y la investigación de biología química de RSC Publishing.
  • Cell Chemical Biology : una revista interdisciplinaria que publica artículos de interés excepcional en todas las áreas en la interfaz entre la química y la biología. chembiol.com
  • Journal of Chemical Biology: una nueva revista que publica trabajos novedosos y reseñas sobre la interfaz entre la biología y las ciencias físicas, publicada por Springer. Enlace
  • Journal of the Royal Society Interface : una publicación interdisciplinaria que promueve la investigación en la interfaz entre las ciencias físicas y de la vida.
  • Molecular BioSystems - Revista de biología química con un enfoque particular en la interfaz entre la química y las ciencias económicas y la biología de sistemas.
  • Nature Chemical Biology : una revista mensual multidisciplinaria que proporciona un foro internacional para la publicación oportuna de nuevas investigaciones importantes en la interfaz entre la química y la biología.
  • Enlace de la Enciclopedia Wiley de Biología Química