Dihidrofolato reductasa , o DHFR , es una enzima que reduce el ácido dihidrofólico a ácido tetrahidrofólico , usando NADPH como donante de electrones , que se puede convertir a los tipos de tetrahidrofolato cofactores utilizados en la química de la transferencia de 1-carbono. En los seres humanos, la enzima DHFR está codificada por el gen DHFR . [5] [6] Se encuentra en la región q11 → q22 del cromosoma 5. [7] Las especies bacterianas poseen distintas enzimas DHFR (según su patrón de unión a moléculas diaminoheterocíclicas), pero los mamíferosLos DHFR son muy similares. [8]
Dihidrofolato reductasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
CE no. | 1.5.1.3 | |||||||
No CAS. | 9002-03-3 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
KEGG | Entrada KEGG | |||||||
MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
Ontología de genes | AmiGO / QuickGO | |||||||
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Dihidrofolato reductasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | DHFR_1 | |||||||
Pfam | PF00186 | |||||||
Clan pfam | CL0387 | |||||||
InterPro | IPR001796 | |||||||
PROSITE | PDOC00072 | |||||||
SCOP2 | 1dhi / SCOPe / SUPFAM | |||||||
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R67 dihidrofolato reductasa | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | DHFR_2 | |||||||
Pfam | PF06442 | |||||||
InterPro | IPR009159 | |||||||
SCOP2 | 1vif / SCOPe / SUPFAM | |||||||
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DHFR | |||||||||||||||||||||||||
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Identificadores | |||||||||||||||||||||||||
Alias | DHFR , DHFRP1, DYR, dihidrofolato reductasa | ||||||||||||||||||||||||
Identificaciones externas | OMIM : 126060 MGI : 94890 HomoloGene : 56470 GeneCards : DHFR | ||||||||||||||||||||||||
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Ortólogos | |||||||||||||||||||||||||
Especies | Humano | Ratón | |||||||||||||||||||||||
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Ubicación (UCSC) | Crónicas 5: 80,63 - 80,65 Mb | Crónicas 13: 92,35 - 92,39 Mb | |||||||||||||||||||||||
Búsqueda en PubMed | [3] | [4] | |||||||||||||||||||||||
Wikidata | |||||||||||||||||||||||||
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Estructura
Una hoja central plegada beta de ocho hebras constituye la característica principal del plegamiento de la estructura polipeptídica de DHFR. [9] Siete de estos hilos son paralelos y el octavo va en antiparalelo. Cuatro hélices alfa conectan sucesivas hebras beta. [10] Los residuos 9-24 se denominan "Met20" o "bucle 1" y, junto con otros bucles, forman parte del subdominio principal que rodea el sitio activo . [11] El sitio activo está situado en la mitad N-terminal de la secuencia, que incluye un dipéptido Pro - Trp conservado ; Se ha demostrado que el triptófano participa en la unión del sustrato por la enzima. [12]
DHFR humano con dihidrofolato unido y NADPH
Función
La dihidrofolato reductasa convierte el dihidrofolato en tetrahidrofolato , una lanzadera de protones necesaria para la síntesis de novo de purinas , ácido timidílico y ciertos aminoácidos . Si bien el gen funcional de la dihidrofolato reductasa se ha mapeado en el cromosoma 5, se han identificado múltiples pseudogenes procesados sin intrones o genes similares a la dihidrofolato reductasa en cromosomas separados. [13]
Reacción catalizada por DHFR.
Vía de síntesis de tetrahidrofolato.
Encontrado en todos los organismos, el DHFR tiene un papel fundamental en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula. El tetrahidrofolato y sus derivados son esenciales para la síntesis de purinas y timidilatos , que son importantes para la proliferación y el crecimiento celular. [14] DHFR juega un papel central en la síntesis de precursores de ácidos nucleicos , y se ha demostrado que las células mutantes que carecen completamente de DHFR requieren glicina, un aminoácido y timidina para crecer. [15] También se ha demostrado que la DHFR es una enzima involucrada en el rescate de tetrahidrobiopterina de dihidrobiopterina [16]
Mecanismo
Mecanismo general
DHFR cataliza la transferencia de un hidruro de NADPH a dihidrofolato con una protonación acompañante para producir tetrahidrofolato . [14] Al final, el dihidrofolato se reduce a tetrahidrofolato y el NADPH se oxida a NADP + . La alta flexibilidad de Met20 y otros bucles cerca del sitio activo juegan un papel en la promoción de la liberación del producto, tetrahidrofolato. En particular, el bucle Met20 ayuda a estabilizar el anillo de nicotinamida del NADPH para promover la transferencia del hidruro del NADPH al dihidrofolato. [11]
El mecanismo de esta enzima es aleatorio por pasos y en estado estable. Específicamente, la reacción catalítica comienza con el NADPH y el sustrato adhiriéndose al sitio de unión de la enzima, seguido de la protonación y la transferencia de hidruro desde el cofactor NADPH al sustrato. Sin embargo, dos últimos pasos no tienen lugar simultáneamente en un mismo estado de transición. [17] [18] En un estudio que utiliza enfoques computacionales y experimentales, Liu et al concluyen que el paso de protonación precede a la transferencia de hidruro. [19]
Se ha demostrado que el mecanismo enzimático de la DHFR depende del pH, en particular del paso de transferencia de hidruro, ya que se ha demostrado que los cambios de pH tienen una influencia notable sobre la electrostática del sitio activo y el estado de ionización de sus residuos. [19] La acidez del nitrógeno objetivo en el sustrato es importante en la unión del sustrato al sitio de unión de la enzima, que ha demostrado ser hidrófobo aunque tenga contacto directo con el agua. [17] [20] Asp27 es el único residuo hidrófilo cargado en el sitio de unión, y la neutralización de la carga en Asp27 puede alterar el pKa de la enzima. Asp27 juega un papel crítico en el mecanismo catalítico al ayudar con la protonación del sustrato y restringir el sustrato en la conformación favorable para la transferencia de hidruro. [21] [17] [20] Se muestra que el paso de protonación está asociado con la tautomerización del enol, aunque esta conversión no se considera favorable para la donación de protones. [18] Se ha demostrado que una molécula de agua está involucrada en el paso de protonación. [22] [23] [24] El bucle Met20 facilita la entrada de la molécula de agua al sitio activo de la enzima. [25]
Cambios conformacionales de DHFR
El ciclo catalítico de la reacción catalizada por DHFR incorpora cinco intermedios importantes: holoenzima (E: NADPH), complejo de Michaelis (E: NADPH: DHF), complejo de producto ternario (E: NADP + : THF), complejo binario de tetrahidrofolato (E: THF). ) y complejo THF, NADPH (E: NADPH: THF). El paso de disociación del producto (THF) de E: NADPH: THF a E: NADPH es el paso que determina la velocidad durante el recambio en estado estable. [21]
Los cambios conformacionales son críticos en el mecanismo catalítico de DHFR. [26] El bucle Met20 de DHFR puede abrir, cerrar u ocluir el sitio activo. [23] [17] En consecuencia, se asignan a Met20 tres conformaciones diferentes clasificadas como estados abierto, cerrado y ocluido. Además, se definió una conformación extra distorsionada de Met20 debido a sus resultados de caracterización indistintos. [23] El bucle Met20 se observa en su conformación ocluida en los tres productos intermedios de ligadura, donde el anillo de nicotinamida se ocluye del sitio activo. Esta característica conformacional explica el hecho de que la sustitución de NADP + por NADPH es anterior a la disociación del producto. Por tanto, la siguiente ronda de reacción puede producirse tras la unión del sustrato. [21]
R67 DHFR
Debido a su estructura única y características catalíticas, R67 DHFR se estudia ampliamente. R67 DHFR es un DHFR codificado por plásmido R de tipo II sin relación genética y estructural con el DHFR cromosómico de E. coli. Es un homotetrámero que posee la simetría 222 con un solo poro del sitio activo que está expuesto al solvente [nulo] [27] Esta simetría del sitio activo da como resultado el modo de unión diferente de la enzima: puede unirse con dos dihidrofolato (DHF ) moléculas con cooperatividad positiva o dos moléculas de NADPH con cooperatividad negativa, o un sustrato más uno, pero solo el último tiene la actividad catalítica. [28] En comparación con el DHFR cromosómico de E. coli, tiene una mayor K m en la unión de dihidrofolato (DHF) y NADPH. La cinética catalítica mucho más baja muestra que la transferencia de hidruro es el paso que determina la velocidad en lugar de la liberación del producto (THF). [29]
En la estructura de R67 DHFR, el homotetrámero forma un poro de sitio activo. En el proceso catalítico, DHF y NADPH ingresan al poro desde la posición opuesta. La interacción de apilamiento π-π entre el anillo de nicotinamida de NADPH y el anillo de pteridina de DHF conecta estrechamente dos reactivos en el sitio activo. Sin embargo, se observó la flexibilidad de la cola de p-aminobenzoilglutamato de DHF tras la unión, lo que puede promover la formación del estado de transición. [30]
Significación clínica
La deficiencia de dihidrofolato reductasa se ha relacionado con la anemia megaloblástica . [13] El tratamiento es con formas reducidas de ácido fólico. Debido a que el tetrahidrofolato, el producto de esta reacción, es la forma activa de folato en humanos, la inhibición de DHFR puede causar una deficiencia funcional de folato . El DHFR es un objetivo farmacéutico atractivo para la inhibición debido a su papel fundamental en la síntesis de precursores de ADN. La trimetoprima , un antibiótico , inhibe la DHFR bacteriana, mientras que el metotrexato , un agente de quimioterapia , inhibe la DHFR de los mamíferos. Sin embargo, se ha desarrollado resistencia contra algunos fármacos, como resultado de cambios mutacionales en la propia DHFR. [31]
Las mutaciones de DHFR causan un raro error innato autosómico recesivo del metabolismo del folato que resulta en anemia megaloblástica , pancitopenia y deficiencia cerebral severa de folato que puede corregirse con suplementos de ácido folínico . [32] [33]
Aplicaciones Terapéuticas
Dado que se necesita folato al dividir rápidamente las células para producir timina , este efecto puede utilizarse con ventaja terapéutica.
La DHFR puede ser un objetivo en el tratamiento del cáncer y como un objetivo potencial contra las infecciones bacterianas. La DHFR es responsable de los niveles de tetrahidrofolato en una célula, y la inhibición de la DHFR puede limitar el crecimiento y la proliferación de células que son características del cáncer y las infecciones bacterianas. El metotrexato , un inhibidor competitivo de la DHFR, es uno de esos fármacos contra el cáncer que inhibe la DHFR. [34] Otros fármacos incluyen trimetoprima y pirimetamina . Estos tres se utilizan ampliamente como agentes antitumorales y antimicrobianos. [35] Otras clases de compuestos que se dirigen a la DHFR en general, y las DHFR bacterianas en particular, pertenecen a clases como las diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, calconas, desoxibenzoínas, por nombrar solo algunas. [36]
Se ha demostrado que la trimetoprima tiene actividad contra una variedad de patógenos bacterianos Gram-positivos . [37] Sin embargo, la resistencia a la trimetoprima y otros fármacos dirigidos a la DHFR puede surgir debido a una variedad de mecanismos, lo que limita el éxito de sus usos terapéuticos. [38] [39] [40] La resistencia puede surgir de la amplificación del gen DHFR, mutaciones en DHFR, [41] [42] disminución en la absorción de los fármacos, entre otros. Independientemente, la combinación de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado como agente antibacteriano durante décadas. [37]
El folato es necesario para el crecimiento, [43] y la vía del metabolismo del folato es un objetivo en el desarrollo de tratamientos para el cáncer. DHFR es uno de esos objetivos. Se demostró que un régimen de fluorouracilo , doxorrubicina y metotrexato prolonga la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico avanzado. [44] Estudios adicionales sobre inhibidores de DHFR pueden conducir a más formas de tratar el cáncer.
Las bacterias también necesitan DHFR para crecer y multiplicarse y, por tanto, los inhibidores selectivos de la DHFR bacteriana han encontrado aplicación como agentes antibacterianos. [37]
Las clases de moléculas pequeñas empleadas como inhibidores de la dihidrofolato reductasa incluyen diaminoquinazolina y diaminopirroloquinazolina, [45] diaminopirimidina, diaminopteridina y diaminotriazinas. [46]
Tratamiento potencial del ántrax
Dihidrofolato reductasa de Bacillus anthracis (BaDHFR), un fármaco objetivo validado en el tratamiento de la enfermedad infecciosa ántrax. El BaDHFR es menos sensible a los análogos de trimetoprima que la dihidrofolato reductasa de otras especies como Escherichia coli , Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae . Una alineación estructural de la dihidrofolato reductasa de las cuatro especies muestra que solo BaDHFR tiene la combinación de fenilalanina y tirosina en las posiciones 96 y 102, respectivamente.
La resistencia del BaDHFR a los análogos de trimetoprima se debe a estos dos residuos (F96 e Y102), que también confieren una cinética y una eficacia catalíticas mejoradas. [47] La investigación actual utiliza mutantes de sitios activos en BaDHFR para orientar la optimización del plomo para nuevos inhibidores de antifolato. [47]
Como herramienta de investigación
La DHFR se ha utilizado como herramienta para detectar interacciones proteína-proteína en un ensayo de complementación de fragmentos de proteína (PCA).
Células CHO
Las células DHFR que carecen de CHO son la línea celular más comúnmente utilizada para la producción de proteínas recombinantes. Estas células se transfectan con un plásmido que lleva el gen dhfr y el gen de la proteína recombinante en un único sistema de expresión , y luego se someten a condiciones selectivas en medio que carece de timidina . Solo las células con el gen DHFR exógeno junto con el gen de interés sobreviven.
Interacciones
Se ha demostrado que la dihidrofolato reductasa interactúa con GroEL [48] y Mdm2 . [49]
Mapa de ruta interactivo
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- ^ El mapa de ruta interactivo se puede editar en WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601" .
Referencias
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enlaces externos
- 1988 Conferencia Nobel de Medicina
- Proteopedia: Dihidrofolato reductasa
- Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P00374 ( Dihidrofolato reductasa) en el PDBe-KB .