Ensayo de cambio de movilidad electroforética
Un ensayo de movilidad electroforética cambio (EMSA) o electroforesis de cambio de movilidad , también conocido como un ensayo de desplazamiento en gel , ensayo de cambio de movilidad en gel , ensayo de desplazamiento de banda , o ensayo de retardo en gel , es un común electroforesis afinidad técnica utilizada para estudio proteína-ADN o proteína - Interacciones de ARN . Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una determinada secuencia de ADN o ARN y, a veces, puede indicar si más de una molécula de proteína está involucrada en el complejo de unión. Los ensayos de desplazamiento de gel a menudo se realizan in vitro.simultáneamente con la huella de ADNasa , la extensión del cebador y los experimentos de promotor-sonda al estudiar el inicio de la transcripción , la replicación de la banda de ADN, la reparación del ADN o el procesamiento y la maduración del ARN, así como el empalme de pre-ARNm. [1] Aunque se pueden encontrar precursores en la literatura anterior, la mayoría de los ensayos actuales se basan en métodos descritos por Garner y Revzin [2] y Fried y Crothers . [3]
Un ensayo de cambio de movilidad es la separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa durante un período corto (alrededor de 1,5 a 2 horas para un gel de 15 a 20 cm). [4] La velocidad a la que diferentes moléculas (y combinaciones de las mismas) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga y, en menor medida, por su forma (ver electroforesis en gel). El carril de control (sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una única banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, asumiendo que la proteína es capaz de unirse al fragmento, el carril con una proteína que se une contendrá otra banda que representa el complejo más grande y menos móvil de la sonda de ácido nucleico unida a la proteína que está 'desplazada' hacia arriba en el gel. (ya que se ha movido más lentamente).
En las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN (o ARN) y la proteína se estabiliza y la proporción de ácido nucleico unido y no unido en el gel refleja la fracción de moléculas sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión entra en el gel. Esta estabilidad se debe en parte a un "efecto de enjaulamiento", en el que la proteína, rodeada por la matriz de gel, no puede difundirse fuera de la sonda antes de que se recombinen. [5] Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. [6]A menos que el complejo tenga una vida muy larga en condiciones de gel, o se tenga en cuenta la disociación durante la electroforesis, el número derivado es un Kd aparente. Si no se conoce la concentración de proteína pero sí la estequiometría compleja, la concentración de proteína se puede determinar aumentando la concentración de la sonda de ADN hasta que los incrementos adicionales no aumenten la fracción de proteína unida. En comparación con un conjunto de diluciones estándar de sonda libre ejecutadas en el mismo gel, se puede calcular el número de moles de proteína. [4]
Se puede agregar un anticuerpo que reconoce la proteína a esta mezcla para crear un complejo aún más grande con un cambio mayor. Este método se denomina ensayo de superdesplazamiento y se utiliza para identificar de forma inequívoca una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.
A menudo, se ejecuta un carril adicional con un oligonucleótido competidor para determinar la secuencia de unión más favorable para la proteína de unión. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite la identificación del sitio de unión preciso por competencia (no se muestra en el diagrama). Las variantes del ensayo de competición son útiles para medir la especificidad de la unión y para medir la cinética de asociación y disociación. Por lo tanto, EMSA también podría usarse como parte de un experimento SELEX para seleccionar oligonucleótidos que realmente se unen a una proteína determinada. [ cita requerida ]
