Los oligonucleótidos son moléculas cortas de ADN o ARN , oligómeros , que tienen una amplia gama de aplicaciones en pruebas genéticas , investigación y análisis forense . [1] Estos pequeños fragmentos de ácidos nucleicos, que se fabrican habitualmente en el laboratorio mediante síntesis química en fase sólida , se pueden fabricar como moléculas monocatenarias con cualquier secuencia especificada por el usuario, por lo que son vitales para la síntesis de genes artificiales , la reacción en cadena de la polimerasa (PCR ), Secuenciación de ADN , clonación molecular y como sondas moleculares. En la naturaleza, los oligonucleótidos se encuentran generalmente como pequeñas moléculas de ARN que funcionan en la regulación de la expresión génica (por ejemplo, microARN ), o son intermedios de degradación derivados de la descomposición de moléculas de ácido nucleico más grandes.
Los oligonucleótidos se caracterizan por la secuencia de residuos de nucleótidos que forman la molécula completa. La longitud del oligonucleótido se indica habitualmente con " -mer " (del griego meros , "parte"). Por ejemplo, un oligonucleótido de seis nucleótidos (nt) es un hexámero, mientras que uno de 25 nt normalmente se llamaría "25-mer". Los oligonucleótidos se unen fácilmente, de una manera específica de secuencia, a sus respectivos oligonucleótidos, ADN o ARN complementarios para formar dúplex o, con menos frecuencia, híbridos de orden superior. Esta propiedad básica sirve como base para el uso de oligonucleótidos como sondas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Los ejemplos de procedimientos que utilizan oligonucleótidos incluyen microarrays de ADN , transferencias Southern , análisis de ASO , hibridación fluorescente in situ (FISH), PCR y síntesis de genes artificiales.
Los oligonucleótidos están compuestos por 2'-desoxirribonucleótidos (oligodesoxirribonucleótidos), que pueden modificarse en la columna vertebral o en la posición del azúcar 2 'para lograr diferentes efectos farmacológicos. Estas modificaciones otorgan nuevas propiedades a los oligonucleótidos y los convierten en un elemento clave en la terapia antisentido . [2] [3]
Síntesis
Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando componentes básicos, fosforamiditas protegidas de nucleósidos naturales o modificados químicamente o, en menor grado, de compuestos no nucleosídicos. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos procede en la dirección 3 'a 5' siguiendo un procedimiento de rutina denominado "ciclo sintético". La finalización de un solo ciclo sintético da como resultado la adición de un residuo de nucleótido a la cadena en crecimiento. Un rendimiento inferior al 100% de cada paso sintético y la aparición de reacciones secundarias establecen límites prácticos de la eficiencia del proceso. En general, las secuencias de oligonucleótidos suelen ser cortas (13-25 nucleótidos de longitud). [4] La longitud máxima de los oligonucleótidos sintéticos apenas supera los 200 residuos de nucleótidos. Se pueden usar HPLC y otros métodos para aislar productos con la secuencia deseada.
Modificaciones químicas
La creación de oligonucleótidos cortos químicamente estables fue el primer desafío en el desarrollo de terapias ASO. Los oligonucleótidos de origen natural se degradan fácilmente por las nucleasas, una enzima que escinde los nucleótidos y es abundante en todos los tipos de células. [5] Las secuencias de oligonucleótidos cortas también tienen afinidades de unión intrínsecas débiles, lo que contribuye a su degradación in vivo. [6]
Modificaciones de la columna vertebral
Los análogos de nucleótidos organotiofosfato (PS) de nucleósidos dan a los oligonucleótidos algunas propiedades beneficiosas. Las propiedades beneficiosas clave que las cadenas principales de PS proporcionan a los nucleótidos son la identificación de diastereoisómeros de cada nucleótido y la capacidad de seguir fácilmente las reacciones que involucran los nucleótidos de fosforotioato, lo cual es útil en la síntesis de oligonucleótidos. [7] Las modificaciones de la columna vertebral de PS a los oligonucleótidos los protegen contra la degradación no deseada por las enzimas. [8] La modificación de la cadena principal de nucleótidos se usa ampliamente porque se puede lograr con relativa facilidad y precisión en la mayoría de los nucleótidos. [7] Se informó de modificaciones fluorescentes en los extremos 5 'y 3' de los oligonucleótidos para evaluar las estructuras, la dinámica y las interacciones de los oligonucleótidos con respecto al medio ambiente. [9]
Modificaciones del anillo de azúcar
Otra modificación que es útil para aplicaciones médicas de oligonucleótidos son las modificaciones de azúcar 2 ' . La modificación del azúcar en la posición 2 'aumenta la eficacia de los oligonucleótidos al mejorar las capacidades de unión a la diana de los oligonucleótidos, específicamente en las terapias con oligonucleótidos antisentido . [6] También disminuyen la unión a proteínas no específicas, lo que aumenta la precisión de la selección de proteínas específicas. [6] Dos de las modificaciones más utilizadas son el 2'-O-metilo y el 2'-O-metoxietilo. [6] También se informaron modificaciones fluorescentes en la nucleobase. [9]
Oligonucleótidos antisentido
Los oligonucleótidos antisentido son cadenas sencillas de ADN o ARN que son complementarias a una secuencia elegida. [4] En el caso del ARN antisentido , previenen la traducción de proteínas de ciertas cadenas de ARN mensajero al unirse a ellas, en un proceso llamado hibridación . [10] Se pueden usar oligonucleótidos antisentido para apuntar a un ARN complementario específico (codificante o no codificante ). Si la unión tiene lugar este híbrido puede ser degradado por la enzima RNasa H . [10] La ARNasa H es una enzima que hidroliza el ARN, y cuando se usa en una aplicación de oligonucleótidos antisentido da como resultado una regulación a la baja del 80-95% de la expresión del ARNm. [4]
El uso de morfolino oligonucleótidos antisentido para caídas de genes en los vertebrados , que ahora es una técnica estándar en la biología del desarrollo y se utiliza para estudiar alterado la expresión del gen y el gen de función, fue desarrollado primero por Janet Heasman utilizando Xenopus . [11] Los fármacos morfolino aprobados por la FDA incluyen eteplirsen y golodirsen . Los oligonucleótidos antisentido también se han utilizado para inhibir la replicación del virus de la influenza en líneas celulares. [12] [13]
Las enfermedades neurodegenerativas que son el resultado de una única proteína mutante son buenos objetivos para las terapias con oligonucleótidos antisentido debido a su capacidad para apuntar y modificar secuencias muy específicas de ARN con alta selectividad. Muchas enfermedades genéticas, incluyendo la enfermedad de Huntington , enfermedad de Alzheimer , enfermedad de Parkinson , y esclerosis lateral amiotrófica (ALS) se han relacionado con alteraciones del ADN que resultan en secuencias de ARN incorrectas y dar como resultado proteínas mal traducidos que tienen un efecto fisiológico tóxico. [14]
Técnicas analíticas
Cromatografia
Las alquilamidas se pueden utilizar como fases estacionarias cromatográficas . [15] Estas fases se han investigado para la separación de oligonucleótidos. [16] La cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa de pares iónicos se utiliza para separar y analizar los oligonucleótidos después de la síntesis automatizada. [17]
Espectrometría de masas
Puede usarse una mezcla de ácido 5-metoxisalicílico y espermina como matriz para el análisis de oligonucleótidos en espectrometría de masas MALDI . [18] La espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS) también es una herramienta poderosa para caracterizar la masa de oligonucleótidos. [19]
Micromatriz de ADN
Los microarrays de ADN son una aplicación analítica útil de oligonucleótidos. En comparación con las micromatrices de ADNc estándar, las micromatrices basadas en oligonucleótidos tienen una especificidad más controlada que la hibridación y la capacidad de medir la presencia y prevalencia de secuencias poliadeniladas o empalmadas alternativamente . [20] Un subtipo de micromatrices de ADN puede describirse como sustratos (nailon, vidrio, etc.) a los que se han unido oligonucleótidos a alta densidad. [21] Hay una serie de aplicaciones de los microarrays de ADN dentro de las ciencias de la vida.
Ver también
- Aptámeros , oligonucleótidos con importantes aplicaciones biológicas
- Morfolinos , oligos con cadenas principales no naturales, que no activan la ARNasa-H pero pueden reducir la expresión génica o modificar el empalme del ARN
- Polimorfismo , la aparición en una población del mismo gen en múltiples formas debido a mutaciones; a menudo se puede probar con sondas ASO
- Oligodesoxinucleótido CpG , un ODN con propiedades inmunoestimuladoras
- Horquillas de polipurina inversa-Hoogsteen , PPRH, oligonucleótidos que pueden unirse al ADN o al ARN y disminuir la expresión génica.
Referencias
- ^ Yang J, Stolee JA, Jiang H, Xiao L, Kiesman WF, Antia FD, et al. (Octubre de 2018). "Síntesis en fase sólida de oligonucleótidos de fosforotioato utilizando subproductos de sulfuración para el recubrimiento in situ". La Revista de Química Orgánica . 83 (19): 11577-11585. doi : 10.1021 / acs.joc.8b01553 . PMID 30179468 .
- ^ Weiss, B., ed. (1997). Oligodesoxinucleótidos antisentido y ARN antisentido: nuevos agentes farmacológicos y terapéuticos. Boca Raton, Florida: CRC Press
- ^ Weiss B, Davidkova G, Zhou LW (1999). "Terapia génica de ARN antisentido para estudiar y modular procesos biológicos". Ciencias de la vida celular y molecular . 55 (3): 334–58. doi : 10.1007 / s000180050296 . PMID 10228554 .
- ^ a b c Dias N, Stein CA (marzo de 2002). "Oligonucleótidos antisentido: conceptos y mecanismos básicos" . Terapéutica del cáncer molecular . 1 (5): 347–55. PMID 12489851 .
- ^ Frazier KS (enero de 2015). "Terapias con oligonucleótidos antisentido: la promesa y los desafíos desde la perspectiva de un patólogo toxicológico". Patología toxicológica . 43 (1): 78–89. doi : 10.1177 / 0192623314551840 . PMID 25385330 .
- ^ a b c d DeVos SL, Miller TM (julio de 2013). "Oligonucleótidos antisentido: tratamiento de la neurodegeneración a nivel de ARN" . Neuroterapéutica . 10 (3): 486–97. doi : 10.1007 / s13311-013-0194-5 . PMC 3701770 . PMID 23686823 .
- ^ a b Eckstein F (abril de 2000). "Oligodesoxinucleótidos de fosforotioato: ¿cuál es su origen y qué tiene de especial?". Desarrollo de fármacos antisentido y de ácidos nucleicos . 10 (2): 117-21. doi : 10.1089 / oli.1.2000.10.117 . PMID 10805163 .
- ^ Stein CA, Subasinghe C, Shinozuka K, Cohen JS (abril de 1988). "Propiedades fisicoquímicas de los oligodesoxinucleótidos de fosforotioato" . Investigación de ácidos nucleicos . 16 (8): 3209–21. doi : 10.1093 / nar / 16.8.3209 . PMC 336489 . PMID 2836790 .
- ^ a b Michel BY, Dziuba D, Benhida R, Demchenko AP, Burger A (2020). "Sondeo de estructuras de ácidos nucleicos, dinámica e interacciones con etiquetas fluorescentes sensibles al medio ambiente" . Fronteras de la química . 8 : 112. doi : 10.3389 / fchem.2020.00112 . PMC 7059644 . PMID 32181238 .
- ^ a b Crooke ST (abril de 2017). "Mecanismos moleculares de oligonucleótidos antisentido" . Terapéutica de ácidos nucleicos . 27 (2): 70–77. doi : 10.1089 / nat.2016.0656 . PMC 5372764 . PMID 28080221 .
- ^ Heasman J, Kofron M, Wylie C (junio de 2000). "Actividad de señalización de beta-catenina diseccionado en el embrión temprano de Xenopus: un nuevo enfoque antisentido". Biología del desarrollo . 222 (1): 124–34. doi : 10.1006 / dbio.2000.9720 . PMID 10885751 .
- ^ Kumar P, Kumar B, Rajput R, Saxena L, Banerjea AC, Khanna M (noviembre de 2013). "Efecto de protección cruzada de oligonucleótido antisentido desarrollado contra el común 3 'NCR del genoma del virus de la influenza A". Biotecnología molecular . 55 (3): 203-11. doi : 10.1007 / s12033-013-9670-8 . PMID 23729285 .
- ^ Kumar B, Khanna M, Kumar P, Sood V, Vyas R, Banerjea AC (mayo de 2012). "La escisión mediada por ácido nucleico del gen M1 del virus de la influenza A aumenta significativamente mediante moléculas antisentido dirigidas a hibridar cerca del sitio de escisión". Biotecnología molecular . 51 (1): 27–36. doi : 10.1007 / s12033-011-9437-z . PMID 21744034 .
- ^ Smith RA, Miller TM, Yamanaka K, Monia BP, Condon TP, Hung G, et al. (Agosto de 2006). "Terapia de oligonucleótidos antisentido para enfermedades neurodegenerativas" . La Revista de Investigación Clínica . 116 (8): 2290–6. doi : 10.1172 / JCI25424 . PMC 1518790 . PMID 16878173 .
- ^ Buszewski B, Kasturi P, Gilpin RK, Gangoda ME, Jaroniec M (agosto de 1994). "Estudios cromatográficos y afines de fases de alquilamida". Cromatografía . 39 (3–4): 155–61. doi : 10.1007 / BF02274494 .
- ^ Buszewski B, Safaei Z, Studzińska S (enero de 2015). "Análisis de oligonucleótidos por cromatografía líquida con fase estacionaria de alquilamida" . Química abierta . 13 (1). doi : 10.1515 / chem-2015-0141 .
- ^ "Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa de pares iónicos de oligonucleótidos: predicción de retención" . Journal of Chromatography A . 958 (1–2): 167–182. 2002-06-07. doi : 10.1016 / S0021-9673 (02) 00306-0 . ISSN 0021-9673 .
- ^ Distler AM, Allison J (abril de 2001). "Ácido 5-metoxisalicílico y espermina: una nueva matriz para el análisis de espectrometría de masas de ionización / desorción láser asistida por matriz de oligonucleótidos". Revista de la Sociedad Estadounidense de Espectrometría de Masas . 12 (4): 456–62. doi : 10.1016 / S1044-0305 (01) 00212-4 . PMID 11322192 .
- ^ Shah S, Friedman SH (marzo de 2008). "Un método ESI-MS para la caracterización de oligonucleótidos nativos y modificados utilizados para la interferencia de ARN y otras aplicaciones biológicas". Protocolos de la naturaleza . 3 (3): 351–6. doi : 10.1038 / nprot.2007.535 . PMID 18323805 .
- ^ Relógio A, Schwager C, Richter A, Ansorge W, Valcárcel J (junio de 2002). "Optimización de microarrays de ADN basados en oligonucleótidos" . Investigación de ácidos nucleicos . 30 (11): e51. doi : 10.1093 / nar / 30.11.e51 . PMC 117213 . PMID 12034852 .
- ^ Gong P, Harbers GM, Grainger DW (abril de 2006). "Comparación de múltiples técnicas de densidad de superficie de oligonucleótidos inmovilizados e hibridados en portaobjetos de microarrays reactivos con amina comerciales". Química analítica . 78 (7): 2342–51. doi : 10.1021 / ac051812m . PMID 16579618 .
Otras lecturas
- Spingler B (enero de 2012). "Capítulo 3. Cambios conformacionales de oligonucleótidos promovidos por iones metálicos". En Sigel A, Sigel H, Sigel RK (eds.). Interacción entre iones metálicos y ácidos nucleicos . 10 . Springer Science & Business Media. págs. 103-118. doi : 10.1007 / 978-94-007-2172-2_3 .
enlaces externos
- Atlas de RNAi : una base de datos de bibliotecas de RNAi y los resultados del análisis de sus objetivos
- physorg.com | Fuente genética de distrofia muscular neutralizada