Pasquini nació en Ferrara y estudió con Alessandro Milleville (1521?-1589). Fue descrito por Agostino Superbi (1620) como un músico y organista muy inteligente y excelente. "Tenía una mano muy ágil y, a veces, tocaba tan espléndidamente que embelesaba a la gente y realmente la asombraba". En la década de 1580, Pasquini se hizo cargo de la instrucción musical de las hijas de Giovan Battista Aleotti , arquitecto de la corte de Ferrara, de Milleville.
El 1 de mayo de 1592, Pasquini se convirtió en organista de los ridotti de Mario Bevilacqua y de la iglesia de Olivetia , Santa Maria in Organo , en Verona. Mientras ocupó estos cargos, escribió y publicó una favola boscareccia titulada I fidi amanti (Verona, 1593) en previsión de la boda de Don Carlo Gesualdo y Eleonora d'Este que tuvo lugar en Ferrara al año siguiente (1594). Tras la muerte de Bevilacqua, Pasquini aparentemente regresó a Ferrara, donde sucedió a Luzzasco Luzzaschi como organista de la Accademia della Morte. Fue sucedido en este cargo por Girolamo Frescobaldi .
El 6 de octubre de 1597, Pasquini fue elegido organista de la Capella Giulia en la Basílica de San Pedro en Roma . Durante el verano y el otoño de 1604, asumió el mismo cargo en Santo Spirito in Sassia , continuando con sus deberes en San Pedro. A partir de 1603, aparece alguna irregularidad en la firma de su pago, de la Capella Giulia. Nicolo Pasquini, posiblemente un hijo, firmó de vez en cuando desde septiembre de 1603 durante los dos años siguientes. Durante el verano de 1605, sus pagos fueron firmados por el maestro di capella, Francesco Soriano, y en noviembre y diciembre firmó el encargado del hospital donde Pasquini estaba siendo atendido. El 19 de mayo de 1608, Pasquini fue destituido de su cargo por "justas causas". En un relato de Agostino Faustini en 1646, Pasquini murió loco en Roma.
Se han conservado unas treinta piezas para teclado en copias manuscritas. No ha sobrevivido ningún autógrafo y ninguno se publicó durante su vida. Entre las piezas que nos han llegado se encuentran 6 toccatas, 2 durezze, 9 o 10 canzonas, 5 juegos de variaciones, 3 danzas y una intabulación del madrigal Ancor che co'l partire de Cipriano de Rore . Estas obras muestran a Pasquini como un compositor muy original, que en muchos aspectos presagia las obras para teclado de su compatriota más joven, Girolamo Frescobaldi. Sus Durezze son los primeros conocidos de su tipo.
De sus obras vocales, solo cinco se publicaron durante su vida o poco después. El madrigal Mentre che la bell'Isse de 1591, aparece como un motete contrafacto Sanctus Sebastianus en una colección de Passau. Dos motetes, incluido el impresionante Quem viditis pastores? a diez voces, fueron incluidos en una publicación de su alumna, Raffaella Aleotti en 1593. Un madrigal espiritual M'empio gli occhi di pianto, con texto de Angelo Grillo , apareció en 1604, y la obra final, publicada tras su muerte, es Jesu decus angelicum para cuatro voces y órgano.