La anisotropía de fluorescencia o polarización de fluorescencia es el fenómeno en el que la luz emitida por un fluoróforo tiene intensidades desiguales a lo largo de diferentes ejes de polarización . Los primeros pioneros en el campo incluyen a Aleksander Jablonski , Gregorio Weber , [1] y Andreas Albrecht. [2] Los principios de la polarización por fluorescencia y algunas aplicaciones del método se presentan en el libro de Lakowicz. [3]
Definición de anisotropía de fluorescencia
La anisotropía (r) de una fuente de luz se define como la relación entre el componente polarizado y la intensidad total (): [3]
Cuando la excitación está polarizada a lo largo del eje z, la emisión del fluoróforo es simétrica alrededor del eje z (Figura). Por tanto, estadísticamente tenemos. Como, y , tenemos
.
Principio: movimiento browniano y fotoselección
En la fluorescencia, [4] una molécula absorbe un fotón y se excita a un estado de mayor energía. Después de un breve retraso (el promedio representado como la vida útil de la fluorescencia), desciende a un estado inferior al perder parte de la energía en forma de calor y emitir el resto de la energía como otro fotón. La excitación y desexcitación implican la redistribución de electrones alrededor de la molécula. Por tanto, la excitación por un fotón sólo puede ocurrir si el campo eléctrico de la luz está orientado en un eje particular alrededor de la molécula. Además, el fotón emitido tendrá una polarización específica con respecto a la molécula.
El primer concepto que se debe comprender para las mediciones de anisotropía es el concepto de movimiento browniano . Aunque el agua a temperatura ambiente contenida en un vaso a la vista puede parecer muy quieta, a nivel molecular cada molécula de agua tiene energía cinética y, por lo tanto, hay un número continuo de colisiones entre las moléculas de agua. Una nanopartícula (punto amarillo en la figura) suspendida en solución sufrirá una caminata aleatoria debido a la suma de estas colisiones subyacentes. El tiempo de correlación rotacional ( Φ r ), el tiempo que tarda la molécula en rotar 1 radianes, depende de la viscosidad ( η ), la temperatura (T), la constante de Boltzmann ( k B ) y el volumen ( V ) de la nanopartícula: [5]
El segundo concepto es la fotoselección mediante el uso de una luz polarizada. Cuando se aplica luz polarizada a un grupo de fluoróforos orientados aleatoriamente, la mayoría de las moléculas excitadas serán aquellas orientadas dentro de un rango particular de ángulos a la polarización aplicada. Si no se mueven, la luz emitida también se polarizará dentro de un rango particular de ángulos a la luz aplicada.
Para la excitación de fotón único, la anisotropía intrínseca r 0 tiene un valor teórico máximo de 0,4 cuando los dipolos de excitación y emisión son paralelos y un valor mínimo de -0,2 cuando los dipolos de excitación y emisión son perpendiculares.
donde β es el ángulo entre los dipolos de excitación y emisión. Para las mediciones de fluorescencia en estado estacionario, generalmente se mide incrustando el fluoróforo en un poliol congelado .
Tomando el caso idealista más simple, un subconjunto de moléculas de colorante suspendidas en solución que tienen una vida útil de fluorescencia monoexponencial. y r 0 = 0,4 (rodamina 6 g en etilenglicol hecho para tener una absorbancia de ~ 0,05 es una buena muestra de prueba). Si la excitación no está polarizada, la emisión de fluorescencia medida también debería estar despolarizada. Sin embargo, si la fuente de excitación se polariza verticalmente utilizando un polarizador de excitación, los efectos de polarización se detectarán en la fluorescencia medida. Estos artefactos de polarización se pueden combatir colocando un polarizador de emisión en el ángulo mágico de 54,7º. Si el polarizador de emisión está polarizado verticalmente, habrá una pérdida adicional de fluorescencia ya que el movimiento browniano da como resultado que las moléculas de colorante se muevan desde una configuración polarizada vertical inicial a una configuración no polarizada. Por otro lado, si el polarizador de emisión está polarizado horizontalmente, habrá una introducción adicional de moléculas excitadas que inicialmente se polarizaron verticalmente y se despolarizaron a través del movimiento browniano. La suma y la diferencia de fluorescencia se pueden construir sumando las intensidades y restando las intensidades de fluorescencia respectivamente:
Dividir la diferencia por la suma da la desintegración de la anisotropía:
El factor de rejilla G es una preferencia instrumental de la óptica de emisión por la orientación horizontal a la orientación vertical. Puede medirse moviendo el polarizador de excitación a la orientación horizontal y comparando las intensidades cuando el polarizador de emisión está polarizado vertical y horizontalmente, respectivamente.
G depende de la longitud de onda de emisión. La nota G en la literatura se define como la inversa que se muestra.
El grado de descorrelación en la polarización de la luz incidente y emitida depende de la rapidez con la que se codifica la orientación del fluoróforo (la vida útil rotacional ) en comparación con la vida útil de la fluorescencia (). La alteración de las orientaciones puede ocurrir por el volteo de toda la molécula o por la rotación de solo la parte fluorescente. La tasa de volteo está relacionada con la anisotropía medida por la ecuación de Perrin:
Donde r es la anisotropía observada, r 0 es la anisotropía intrínseca de la molécula, es la vida útil de la fluorescencia y es el tiempo de correlación rotacional. [6]
Este análisis es válido solo si los fluoróforos están relativamente separados. Si están muy cerca de otra, pueden intercambiar energía por FRET y debido a que la emisión puede ocurrir desde una de las muchas moléculas que se mueven (u orientadas) independientemente, esto da como resultado una anisotropía menor de la esperada o una mayor descorrelación. Este tipo de transferencia de energía de resonancia de Förster de homotransferencia se denomina migración de energía FRET o emFRET .
La anisotropía de fluorescencia en estado estacionario solo da una anisotropía "promedio". Se puede obtener mucha más información con la anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo [7], donde el tiempo de desintegración, la anisotropía residual y el tiempo de correlación rotacional se pueden determinar a partir del ajuste de la desintegración de la anisotropía. Por lo general, se utiliza una fuente de láser de impulsos verticales para la excitación y la electrónica de sincronización se agrega entre los pulsos de inicio del láser (inicio) y la medición de los fotones de fluorescencia (parada). Normalmente se emplea la técnica de recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC).
Nuevamente, usando el caso idealista más simple, un subconjunto de moléculas de colorante suspendidas en una solución que tienen una vida útil de fluorescencia monoexponencial. y una anisotropía inicial r 0 = 0,4. Si la muestra se excita con una fuente de excitación pulsada orientada verticalmente, entonces un solo tiempo de decaimientodebe medirse cuando el polarizador de emisión está en el ángulo mágico. Si el polarizador de emisión está polarizado verticalmente en su lugar, se medirán dos tiempos de caída, ambos con factores preexponenciales positivos, el primer tiempo de caída debe ser equivalente amedido con la configuración de emisión no polarizada y el segundo tiempo de desintegración se debe a la pérdida de fluorescencia, ya que el movimiento browniano da como resultado que las moléculas de tinte se muevan desde una configuración polarizada vertical inicial a una configuración no polarizada. Por otro lado, si el polarizador de emisión está polarizado horizontalmente, se recuperarán dos tiempos de decaimiento nuevamente el primero con un factor preexponencial positivo y será equivalente apero el segundo tendrá un factor preexponencial negativo resultante de la introducción de moléculas excitadas que inicialmente se polarizaron verticalmente y se despolarizaron mediante el movimiento browniano. La suma y la diferencia de la fluorescencia se pueden construir sumando las desintegraciones y restando las desintegraciones de la fluorescencia, respectivamente:
Dividir la diferencia por la suma da la desintegración de la anisotropía:
En el caso más simple para una sola especie de tinte esférico:
Aplicaciones
La anisotropía de fluorescencia se puede utilizar para medir las constantes de unión y la cinética de las reacciones que provocan un cambio en el tiempo de rotación de las moléculas. Si el fluoróforo es una molécula pequeña, la velocidad a la que cae puede disminuir significativamente cuando se une a una proteína grande. Si el fluoróforo está unido a la proteína más grande en un par de unión, la diferencia de polarización entre los estados unido y no unido será menor (porque la proteína no unida ya será bastante estable y caerá lentamente para empezar) y la medición será menos precisa. . El grado de unión se calcula usando la diferencia en la anisotropía de los estados parcialmente unido, libre y completamente unido (gran exceso de proteína) medido titulando los dos socios de unión.
Si el fluoróforo está unido a una molécula relativamente grande como una proteína o un ARN, el cambio en la movilidad que acompaña al plegamiento se puede utilizar para estudiar la dinámica del plegamiento. Esto proporciona una medida de la dinámica de cómo la proteína alcanza su forma 3D estable y final.
La anisotropía de fluorescencia también se aplica a la microscopía, con el uso de polarizadores en el camino de la luz iluminante y también antes de la cámara. Esto se puede utilizar para estudiar la viscosidad local del citosol o las membranas, y estas últimas proporcionan información sobre la microestructura de la membrana y las concentraciones relativas de varios lípidos. Esta técnica también se ha utilizado para detectar la unión de moléculas a sus socios en cascadas de señalización en respuesta a ciertas señales.
El fenómeno de emFRET y la disminución asociada de anisotropía cuando ocurren interacciones cercanas entre fluoróforos se ha utilizado para estudiar la agregación de proteínas en respuesta a la señalización.
Ver también
Referencias
- ^ Weber, G., 1953. Movimiento browniano rotacional y polarización de la fluorescencia de soluciones. Adv. Protein Chem. 8: 415-459
- ^ Albrecht, A., 1961. Polarizaciones y asignaciones de transiciones: el método de la fotoselección. J. Mol. Spectrosc. 6: 84-108.
- ↑ a b Lakowicz, JR, 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy (3ª ed., Springer. El capítulo 10-12 trata de la espectroscopia de polarización de fluorescencia).
- ^ Estándares en espectrometría de fluorescencia - Espectrometría ultravioleta | J. Miller | Springer . www.springer.com . Técnicas en Espectrometría Visible y Ultravioleta. Saltador. 1981. ISBN 9789400959040. Consultado el 16 de enero de 2016 .
- ^ Birch, DavidJ.S .; Yip, Philip (1 de enero de 2014). "Nanometrología" (PDF) . En Engelborghs, Yves; Visser, Antonie JWG (eds.). Espectroscopía y microscopía de fluorescencia . Métodos en Biología Molecular. 1076 . Prensa Humana . págs. 279-302. doi : 10.1007 / 978-1-62703-649-8_11 . ISBN 978-1-62703-648-1. PMID 24108630 .
- ^ Valeur, Bernard. 2001. Fluorescencia molecular: principios y aplicaciones Wiley-VCH, p.29
- ^ Birch, David JS; Imhof, Robert E. (1 de enero de 2002). "Espectroscopia de fluorescencia en el dominio del tiempo utilizando el recuento de fotón único correlacionado en el tiempo". En Lakowicz, Joseph R. (ed.). Temas de espectroscopia de fluorescencia . Temas de espectroscopia de fluorescencia. 1 . Springer EE . UU . págs. 1–95. doi : 10.1007 / 0-306-47057-8_1 . ISBN 978-0-306-43874-5.