D-aminoácidos fluorescentes
Los D-aminoácidos fluorescentes (FDAA, por sus siglas en inglés) son derivados de D-aminoácidos cuya cadena lateral terminal está acoplada covalentemente con una molécula de fluoróforo . [1] Los FDAA se incorporan al peptidoglicano bacteriano (PG) en bacterias vivas, lo que da como resultado un fuerte marcado de PG periférico y septal sin afectar el crecimiento celular. Se presentan con sus mecanismos de incorporación in situ que permiten el seguimiento en el tiempo de la formación de nuevos PG. [2] Hasta la fecha, los FDAA se han empleado para estudiar la síntesis de la pared celular en varias especies bacterianas (tanto Gram-positivas como Gram-negativas ) a través de diferentes técnicas, como la microscopía ., espectrometría de masas , citometría de flujo .
FDAA consta de un D-aminoácido y un fluoróforo (acoplados a través de la cadena lateral del aminoácido). El esqueleto del D-aminoácido es necesario para su incorporación en el peptidoglicano bacteriano a través de la actividad de las DD-transpeptidasas . [3] Una vez incorporado, se pueden utilizar técnicas de detección de fluorescencia para visualizar la ubicación de la formación de nuevas PG, así como la tasa de crecimiento. [4]
La D-alanina es el D-aminoácido mejor estudiado para el desarrollo de la FDAA porque es un residuo que existe de forma natural en las estructuras de peptidoglicanos bacterianos. Por otro lado, se han empleado varios fluoróforos para aplicaciones FDAA y cada uno tiene sus características. [5] Por ejemplo, el FDAA basado en cumarina (HADA) es lo suficientemente pequeño como para penetrar las membranas externas bacterianas y, por lo tanto, se usa ampliamente para estudios de bacterias Gram-negativas; mientras que FDAA (TADA) basado en TAMRA presenta su alto brillo y foto/termoestabilidad, que es adecuado para microscopía de superresolución (se utiliza luz de excitación intensa). [5]
El peptidoglicano (PG) es una estructura similar a una malla que contiene polisacáridos entrecruzados por cadenas peptídicas. [6] Las proteínas de unión a penicilina (DD-transpeptidasas), en PBP abreviadas, reconocen los péptidos PG y catalizan las reacciones de entrecruzamiento. [7] Se informa que estas enzimas tienen una alta especificidad hacia el centro de quiralidad del esqueleto de aminoácidos (el centro D-quiral), pero una especificidad relativamente baja hacia la estructura de la cadena lateral. Por lo tanto, cuando los FDAA están presentes, las PBP los toman para las reacciones de entrecruzamiento, lo que resulta en su incorporación a las cadenas peptídicas de PG. A la concentración adecuada, por ejemplo, 1-2 mM, el marcaje con FDAA no afecta la síntesis de PG ni el crecimiento celular porque solo el 1-2 % de las cadenas peptídicas de PG están marcadas con FDAA. [2]
