Force Spectrum Microscopy (FSM) es una aplicación de microrreología activa desarrollada para medir fuerzas aleatorias agregadas en el citoplasma . [1] Los trazadores de flujo grandes e inertes se inyectan en las células vivas y se alojan dentro de la malla citoesquelética , donde se hace oscilar por las repercusiones de las proteínas motoras activas. La magnitud de estas fuerzas aleatorias se puede inferir de la frecuencia de oscilación de las partículas trazadoras. El seguimiento de las fluctuaciones de las partículas trazadoras mediante microscopía óptica puede aislar la contribución de las fuerzas aleatorias activas al transporte molecular intracelular de la del movimiento browniano .
Principios básicos
FSM fue desarrollado por Ming Guo y David A. Weitz para sondear las fuerzas intracelulares estocásticas generadas por proteínas motoras. [1] Lejos de un vacío líquido, el citoplasma contiene una compleja red de actina y miosina que confiere soporte estructural a la célula, además de albergar vesículas y mitocondrias entre otros orgánulos. [2] Investigaciones recientes sobre el apiñamiento macromolecular dentro del citoplasma plantea dudas sobre si el movimiento de tipo difusivo de moléculas grandes se ha atribuido erróneamente a las fuerzas brownianas. [3] En cambio, existen sospechas de que las proteínas motoras de la miosina , que tiran aleatoriamente de los filamentos de actina incrustados con moléculas grandes, dan lugar a un movimiento difusivo de moléculas dentro de las células. [3] [4] Guo y col. desarrolló un ensayo para distinguir si el movimiento de partículas dentro de las células es impulsado por difusión térmica o por repercusiones de proteínas motoras activas como la miosina II no muscular que sacude el citoesqueleto celular.
FSM se basa en la inyección de partículas trazadoras recubiertas con polietilenglicol (PEG) más grandes que el tamaño de la malla del citoesqueleto (> 50 nm), [5] estableciéndose entre una red de filamentos de actina y proteínas motoras de miosina. A medida que las proteínas motoras de miosina tiran de los filamentos de actina para realizar el trabajo celular, estas fluctuaciones de actina oscilan invariablemente las partículas PEGiladas vecinas. La magnitud de la fluctuación del marcador es proporcional a la magnitud de las fuerzas motoras activas agregadas. Por lo tanto, al registrar el desplazamiento de las oscilaciones del trazador, FSM puede medir y derivar la magnitud de las fuerzas ejercidas por las proteínas motoras activas. [1]
Medida de fuerza
Las fluctuaciones de los trazadores PEGilados acoplados a las fuerzas motoras de miosina agregadas se pueden comparar a un resorte Hookean ,
donde la fuerza aplicado para generar el desplazamiento de oscilación es proporcional a la constante de resorte efectiva del entorno intracelular. El desplazamiento durante la oscilación es una función espacial del tiempo, que se puede medir directamente con microscopía óptica. [1] Una transformada de Fourier luego mapea la información en el dominio temporal al dominio de la frecuencia para derivar una dimensión útil en función de la frecuencia,
dónde , y son formas cuadráticas de fuerza, elasticidad y desplazamiento promediados que se utilizan para explicar las fuerzas estocásticas. [1] Desplazamiento cuadrático medio promediado en el tiempo ,puede recuperarse mediante una transformada de Fourier desde el dominio de la frecuencia hasta el dominio temporal. En el contexto de la frecuencia de oscilación, cuanto mayor es el espectro de frecuencia de fuerza, mayor es la actividad metabólica de la célula. [6] Las mediciones micromecánicas independientes pueden calcular la elasticidad del citoplasma. Mediante el uso de una pinza óptica para aplicar una fuerza prescrita a una partícula trazadora, FSM puede medir el desplazamiento resultante para estimar la constante elástica del resorte. [7] [8]
Aplicaciones
Fluidez citoplasmática
La oscilación dirigida de las partículas trazadoras usando pinzas ópticas resultó en un desplazamiento que estaba casi sincronizado con la fuerza aplicada, lo que sugiere que el citoplasma está materialmente más cerca de un sólido elástico. [1] Esto está en marcado contraste con la hipótesis anterior de que el citoplasma es un fluido viscoelástico en el que las moléculas grandes pueden difundirse libremente. [9] En las células agotadas en ATP , en las que se inactiva la miosina II no muscular, los experimentos de FSM revelan que las partículas trazadoras dejan de oscilar como si el citoplasma se hubiera solidificado. [1] La miosina II son proteínas motoras que se unen y tiran de los filamentos de actina a través de la hidrólisis de ATP. [10] Esto corrobora aún más el hallazgo de que en las bacterias carentes de nutrientes , el citoplasma se convierte en una sustancia similar al vidrio. [11] Por lo tanto, la hidrólisis de ATP por las proteínas motoras parece ser fundamental para mantener la fluidez citoplasmática, que es crucial para el transporte de vesículas y el movimiento de difusión en el citoesqueleto. [1]
Diagnóstico diferencial de cáncer maligno
Al medir el estado general de actividad dentro de una célula, la FSM se puede aplicar para identificar células cancerosas malignas, que son característicamente más elásticas [12] y más móviles. Las mediciones de FSM en células malignas de cáncer de mama MCF-7 y células benignas de cáncer de mama MCF-10A revelaron una separación estadísticamente significativa en el espectro de fuerza que permite a FSM analizar el cáncer metastásico . [1] La dimensionalidad del entorno extracelular influye en gran medida en las mediciones de FSM de las células cancerosas. En una matriz 3D, las células de cáncer de mama metastásico MDA-MB-231 tenían un citoplasma comparativamente más sólido que las contrapartes cultivadas en placas 2D. [13]
Referencias
- ^ a b c d e f g h i Guo, Ming; Ehrlicher, Allen J .; Jensen, Mikkel H .; Renz, Malte; Moore, Jeffrey R .; Goldman, Robert D .; Lippincott-Schwartz, Jennifer; Mackintosh, Frederick C .; Weitz, David A. (14 de agosto de 2014). "Prueba de las propiedades estocásticas, motor-drive del citoplasma utilizando microscopía de espectro de fuerza" . Celular . 158 : 822–832. doi : 10.1016 / j.cell.2014.06.051 . PMC 4183065 . PMID 25126787 .
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