La ribozima en horquilla es una pequeña sección de ARN que puede actuar como ribozima . Al igual que la ribozima cabeza de martillo , se encuentra en satélites de ARN de virus de plantas. Se identificó por primera vez en la hebra negativa del ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (TRSV), donde cataliza las reacciones de autoescisión y unión ( ligación ) para procesar los productos de la replicación del virus del círculo rodante en moléculas de ARN satélite lineales y circulares. La ribozima de horquilla es similar a la ribozima de cabeza de martillo en que no requiere un ion metálico para la reacción.
Función biológica
La ribozima en horquilla es un motivo de ARN que cataliza las reacciones de procesamiento de ARN esenciales para la replicación de las moléculas de ARN satélite en las que está incrustada. Estas reacciones son autoprocesado, es decir, una molécula reordena su propia estructura. Tanto las reacciones de escisión como las de unión de extremos están mediadas por el motivo ribozima, lo que conduce a una mezcla de moléculas de ARN satélite lineales y circulares interconvertibles. Estas reacciones son importantes para procesar las grandes moléculas de ARN multiméricas que se generan mediante la replicación del círculo rodante . Al final del ciclo de replicación, estos grandes intermediarios de la replicación del ARN satélite se procesan en moléculas de longitud unitaria (circulares o lineales) antes de que los virus puedan empaquetarlos y llevarlos a otras células para más rondas de replicación. [1]
Versiones naturales de la ribozima horquilla
En la década de 1980, la ribozima en horquilla se identificó en 3 secuencias naturales y bien caracterizadas:
- ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (sTRSV) [3] [4]
- ARN satélite del virus del moteado amarillo de la achicoria (sCYMV) [5]
- ARN satélite del virus del mosaico arabis (sARMV) [6]
Un trabajo posterior en 2021 reveló casi 1000 secuencias de ribozimas en horquilla en organismos en gran parte desconocidos que se encuentran en los datos del metatranscriptoma . [7] Se formuló la hipótesis [7] de que estas secuencias más nuevas se producían en organismos que, como los que contienen las tres ribozimas en horquilla encontradas anteriormente, utilizan genomas de ARN circulares de una sola hebra. La circularidad de los genomas fue apoyada experimentalmente, pero la naturaleza adicional de los organismos aún no está bien estudiada.
Versiones artificiales de la ribozima horquilla.
Se han desarrollado versiones artificiales más pequeñas de la ribozima en horquilla para permitir un análisis experimental más detallado de la molécula. [8] Esta es una estrategia comúnmente utilizada para separar aquellas partes de una molécula de ARN autoprocesado que son esenciales para las reacciones de procesamiento de ARN de aquellas partes que cumplen funciones no relacionadas. Mediante este proceso, se identificaron un dominio catalítico mínimo de 50 nucleótidos y un sustrato de 14 nucleótidos . [9] Usando estas secuencias derivadas artificialmente, se desarrolló una ribozima que actúa en trans y que puede catalizar la escisión de múltiples moléculas de sustrato. Esta estrategia fue importante porque permitió a los investigadores (i) aplicar métodos bioquímicos para el análisis enzimático, (ii) realizar experimentos para identificar elementos estructurales esenciales del complejo ribozima-sustrato, y (iii) desarrollar ribozimas modificadas genéticamente que se han utilizado para fines biomédicos. aplicaciones, incluida la prevención de la replicación de virus patógenos y el estudio de la función de genes individuales.
Química de reacción
Al igual que otras ribozimas y ribonucleasas proteicas, la reacción de escisión de la ribozima en horquilla genera fragmentos de ARN con extremos que consisten en un fosfato cíclico 2 ', 3' y un grupo hidroxilo 5 '. La reacción de ligación parece ser una simple inversión de la escisión, es decir, la unión covalente de fragmentos de ARN que terminan con un 2 ', 3'-fosfato cíclico y un grupo 5'-hidroxilo para generar el enlace fosfodiéster 3'-5' ordinario utilizado en ambos ARN y ADN.
Los estudios de esta reacción en múltiples ribozimas han servido para establecer que la química de reacción (mecanismo catalítico) es una propiedad endógena de la propia molécula de ARN y no está mediada por iones metálicos, como ocurre con algunas enzimas proteicas y algunas otras ribozimas. [10] Además, todavía se observa actividad de escisión cuando el Mg 2+ se reemplaza por [Co (NH 3 ) 6 ] 3+ . [11] El Co 3+ se une al NH 3 con tanta fuerza en la solución que el NH 3 no se disocia de manera apreciable y, por lo tanto, no se protona. Esto sugiere que no hay transferencia de protones catalizada por metales ni coordinación directa con el ARN, sino que solo se requieren metales para el plegado. Además, en las estructuras cristalinas de un complejo inhibidor de ribozima y un imitador del estado de transición, se demostró que la arquitectura tridimensional separa A-1 y G + 1, colocando el 2'-OH de A-1 para un línea de ataque nucleofílico en el enlace fosfato escindible. Además, se ha sugerido que G8, A38 y A9 desempeñan funciones en la catálisis desprotonando el 2'-OH de A-1, estabilizando la carga negativa en desarrollo de los oxígenos fosfato pentacoordinados y protonando el grupo saliente 5'-O de G + 1. [12] [13]
Estructura
El complejo mínimo de sustrato-ribozima en horquilla se pliega en una estructura secundaria que incluye dos dominios, cada uno de los cuales consta de dos hélices apareadas de bases cortas separadas por un bucle interno. El dominio A (hélice 1 - bucle A - hélice 2) contiene el sustrato y la región de reconocimiento de sustrato primario de la ribozima. El dominio B (hélice 3 - bucle B - hélice 4) es más grande y contiene los determinantes catalíticos primarios de la ribozima. Los dos dominios se unen covalentemente mediante un enlace fosfodiéster que conecta la hélice 2 con la hélice 3. Estos dominios deben interactuar entre sí para que se produzca la catálisis. [15]
Cuando se permite que el complejo mínimo de ribozima-sustrato se pliegue en condiciones de baja fuerza iónica , los dos dominios se apilan uno encima del otro, formando una estructura extendida inactiva que se asemeja a una horquilla. [16] Para que ocurra la catálisis, los dos dominios se encuentran paralelos entre sí en un pliegue que se asemeja a un clip. En diversas publicaciones, este ARN se ha denominado ribozima "clip" o "horquilla". A pesar de que el primer nombre ha demostrado ser más exacto, el segundo se ha convertido en la nomenclatura comúnmente aceptada. En el laboratorio, se promueve una interacción funcional entre los dos dominios mediante la adición de cationes , cuya carga positiva es suficiente para superar la repulsión electrostática del esqueleto del ARN cargado negativamente. En la naturaleza, la asociación de los dos dominios es asistida por una combinación de iones metálicos (incluido Mg 2+ ) y la presencia de dos dominios helicoidales adicionales que no están presentes en el complejo mínimo ribozima-sustrato pero que sirven para promover el plegamiento tridimensional adecuado. . Estos dominios adicionales se apilan sobre las hélices 2 y 3, promoviendo así la asociación de los dos dominios funcionales a través de lo que se denomina unión helicoidal de cuatro vías. [17]
La estructura y la actividad de la ribozima de horquilla se ha explorado el uso de una amplia gama de métodos experimentales complementarias, incluida la sustitución de nucleótidos, la sustitución de grupo funcional, la selección combinatoria, espectroscopia de fluorescencia , la reticulación covalente , RMN análisis y cristalografía de rayos x . Estos estudios se han visto facilitados por la capacidad del complejo funcional para autoensamblarse a partir de segmentos elaborados por síntesis química de ARN en fase sólida , lo que permite la incorporación de una amplia variedad de nucleótidos modificados que no se encuentran naturalmente en el ARN. Juntos, los resultados de estos experimentos presentan una imagen muy congruente del ciclo catalítico , es decir, cómo la ribozima en horquilla se une a su sustrato, se pliega en una estructura tridimensional específica, cataliza la reacción y libera el producto o productos de la reacción. [18]
Escisión de ARN dirigida y actividad antiviral
Las ribozimas en horquilla se han modificado de tal manera que pueden usarse para apuntar a la escisión de otras moléculas de ARN. Esto es posible porque gran parte de la especificidad del sustrato de la ribozima en horquilla resulta de un simple emparejamiento de bases de Watson-Crick dentro de las hélices 1 y 2. [19]
Un área de particular interés ha sido el desarrollo de ribozimas en horquilla para uso terapéutico potencial, por ejemplo, evitando la replicación de virus patógenos. Se han generado y expresado ribozimas en horquilla antivirales dentro de células de mamíferos, y se ha demostrado que las células que expresan diferentes ribozimas modificadas genéticamente son resistentes a la infección por VIH-1 , [20] [21] hepatitis B , [22] y virus Sindbis . [23]
Referencias
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enlaces externos
- Página de ribozima horquilla en Rfam