Las ribozimas ( enzimas de ácido ribonucleico ) son moléculas de ARN que tienen la capacidad de catalizar reacciones bioquímicas específicas, incluido el empalme de ARN en la expresión génica , similar a la acción de las enzimas proteicas . El descubrimiento de las ribozimas en 1982 demostró que el ARN puede ser tanto material genético (como el ADN ) como un catalizador biológico (como las enzimas proteicas), y contribuyó a la hipótesis del mundo del ARN , que sugiere que el ARN puede haber sido importante en la evolución de la autoestima prebiótica. sistemas de replicación. [1]Las actividades más comunes de las ribozimas naturales o desarrolladas in vitro son la escisión o ligación de ARN y ADN y la formación de enlaces peptídicos. [2] Dentro del ribosoma , las ribozimas funcionan como parte de la subunidad grande del ARN ribosómico para unir los aminoácidos durante la síntesis de proteínas . También participan en una variedad de reacciones de procesamiento de ARN , incluido el empalme de ARN , la replicación viral y la biosíntesis de ARN de transferencia . Ejemplos de ribozimas incluyen la ribozima cabeza de martillo , la ribozima VS , Leadzyme y la ribozima horquilla .
Los investigadores que estudian el origen de la vida han producido ribozimas en el laboratorio que son capaces de catalizar su propia síntesis a partir de monómeros activados en condiciones muy específicas, como una ribozima de ARN polimerasa . [3] Se ha realizado mutagénesis y selección que ha dado como resultado el aislamiento de variantes mejoradas de la ribozima polimerasa "Round-18" de 2001. "B6.61" puede agregar hasta 20 nucleótidos a una plantilla de cebador en 24 horas, hasta que se descompone por escisión de sus enlaces fosfodiéster. [4] La ribozima "tC19Z" puede agregar hasta 95 nucleótidos con una fidelidad de 0.0083 mutaciones / nucleótido. [5]
Se han realizado intentos para desarrollar ribozimas como agentes terapéuticos, como enzimas que se dirigen a secuencias de ARN definidas para la escisión, como biosensores y para aplicaciones en genómica funcional y descubrimiento de genes. [6]
Descubrimiento
Antes del descubrimiento de las ribozimas, las enzimas , que se definen como proteínas catalíticas , [7] eran los únicos catalizadores biológicos conocidos . En 1967, Carl Woese , Francis Crick y Leslie Orgel fueron los primeros en sugerir que el ARN podría actuar como catalizador. Esta idea se basó en el descubrimiento de que el ARN puede formar estructuras secundarias complejas . [8] Estas ribozimas se encontraron en el intrón de una transcripción de ARN, que se eliminó a sí misma de la transcripción, así como en el componente ARN del complejo RNasa P, que participa en la maduración de los pre ARNt . En 1989, Thomas R. Cech y Sidney Altman compartieron el Premio Nobel de Química por su "descubrimiento de las propiedades catalíticas del ARN". [9] El término ribozima fue introducido por primera vez por Kelly Kruger et al. en 1982 en un artículo publicado en Cell . [1]
Había sido una creencia firmemente establecida en biología que la catálisis se reservaba para las proteínas. Sin embargo, la idea de la catálisis de ARN está motivada en parte por la vieja pregunta sobre el origen de la vida: ¿qué viene primero, las enzimas que hacen el trabajo de la célula o los ácidos nucleicos que transportan la información necesaria para producir las enzimas? El concepto de "ácidos ribonucleicos como catalizadores" evita este problema. El ARN, en esencia, puede ser tanto el huevo como la gallina. [10]
En la década de 1980, Thomas Cech, de la Universidad de Colorado en Boulder , estaba estudiando la escisión de intrones en un gen de ARN ribosómico en Tetrahymena thermophila . Mientras trataba de purificar la enzima responsable de la reacción de empalme, descubrió que el intrón podía empalmarse en ausencia de cualquier extracto celular agregado. Por mucho que lo intentaron, Cech y sus colegas no pudieron identificar ninguna proteína asociada con la reacción de empalme. Después de mucho trabajo, Cech propuso que la parte de la secuencia del intrón del ARN podría romper y reformar los enlaces fosfodiéster . Aproximadamente al mismo tiempo, Sidney Altman, profesor de la Universidad de Yale , estaba estudiando la forma en que se procesan las moléculas de ARNt en la célula cuando él y sus colegas aislaron una enzima llamada ARNasa-P , que es responsable de la conversión de un ARNt precursor en el ARNt. ARNt activo. Para su sorpresa, encontraron que la ARNasa-P contenía ARN además de proteínas y que el ARN era un componente esencial de la enzima activa. Esta era una idea tan extraña que tuvieron dificultades para publicar sus hallazgos. Al año siguiente, Altman demostró que el ARN puede actuar como catalizador al demostrar que la subunidad de ARN de la ARNasa-P podría catalizar la escisión del ARNt precursor en ARNt activo en ausencia de cualquier componente proteico.
Desde el descubrimiento de Cech y Altman, otros investigadores han descubierto otros ejemplos de ARN autoescindible o moléculas de ARN catalítico. Muchas ribozimas tienen un centro activo en forma de horquilla o de cabeza de martillo y una estructura secundaria única que les permite escindir otras moléculas de ARN en secuencias específicas. Ahora es posible producir ribozimas que escinden específicamente cualquier molécula de ARN. Estos catalizadores de ARN pueden tener aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, se ha diseñado una ribozima para escindir el ARN del VIH. Si tal ribozima fuera producida por una célula, todas las partículas de virus entrantes tendrían su genoma de ARN escindido por la ribozima, lo que evitaría la infección.
Estructura y mecanismo
A pesar de tener solo cuatro opciones para cada unidad de monómero (nucleótidos), en comparación con las cadenas laterales de 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, las ribozimas tienen estructuras y mecanismos diversos. En muchos casos, pueden imitar el mecanismo utilizado por sus contrapartes proteicas. Por ejemplo, en los ARN de ribozima autodescindibles, se lleva a cabo una reacción SN2 en línea utilizando el grupo hidroxilo 2 'como nucleófilo que ataca al fosfato puente y provoca que el oxígeno 5' de la base N + 1 actúe como grupo saliente. En comparación, la RNasa A, una proteína que cataliza la misma reacción, usa una histidina y lisina coordinadas para actuar como base para atacar la cadena principal de fosfato. [2] [ aclaración necesaria ]
Como muchas proteínas enzimáticas, la unión de metales también es fundamental para la función de muchas ribozimas. [11] A menudo, estas interacciones utilizan tanto la columna vertebral de fosfato como la base del nucleótido, lo que provoca cambios conformacionales drásticos. [12] Hay dos clases de mecanismos para la escisión de la columna vertebral del fosfodiéster en presencia de metal. En el primer mecanismo, el grupo interno 2'-OH ataca el centro de fósforo en un mecanismo SN 2 . Los iones metálicos promueven esta reacción coordinando primero el fosfato de oxígeno y luego estableciendo el oxianión. El segundo mecanismo también sigue un desplazamiento SN 2 , pero el nucleófilo proviene del agua o de grupos hidroxilo exógenos en lugar del ARN en sí. La ribozima más pequeña es UUU, que puede promover la escisión entre G y A del tetranucleótido GAAA a través del primer mecanismo en presencia de Mn 2+ . La razón por la que este trinucleótido en lugar del tetrámero complementario cataliza esta reacción puede deberse a que el emparejamiento UUU-AAA es el trinucleótido más débil y más flexible entre las 64 conformaciones, que proporciona el sitio de unión para Mn 2+ . [13]
La transferencia de fosforilo también se puede catalizar sin iones metálicos. Por ejemplo, la ribonucleasa A pancreática y las ribozimas del virus de la hepatitis delta (HDV) pueden catalizar la escisión del esqueleto del ARN mediante catálisis ácido-base sin iones metálicos. [14] [15] La ribozima en horquilla también puede catalizar la autodescisión del ARN sin iones metálicos, pero el mecanismo aún no está claro. [15]
La ribozima también puede catalizar la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes al reducir la entropía de activación. [14]
Ocupaciones
Aunque las ribozimas son bastante raras en la mayoría de las células, sus funciones a veces son esenciales para la vida. Por ejemplo, la parte funcional del ribosoma , la máquina biológica que traduce el ARN en proteínas, es fundamentalmente una ribozima, compuesta por motivos estructurales terciarios de ARN que a menudo se coordinan con iones metálicos como Mg 2+ como cofactores . [16] En un sistema modelo, no hay ningún requisito de cationes divalentes en un ARN de cinco nucleótidos que catalice la trans - fenilalación de un sustrato de cuatro nucleótidos con 3 pares de bases complementarios con el catalizador, donde el catalizador / sustrato se diseñó mediante el truncamiento de la ribozima C3. [17]
Las ribozimas mejor estudiadas son probablemente las que se cortan a sí mismas oa otros ARN, como en el descubrimiento original de Cech [18] y Altman. [19] Sin embargo, las ribozimas pueden diseñarse para catalizar una variedad de reacciones (ver más abajo), muchas de las cuales pueden ocurrir en la vida pero no se han descubierto en las células. [20]
El ARN puede catalizar el plegamiento de la conformación proteica patológica de un prión de una manera similar a la de una chaperonina . [21]
Ribozimas y el origen de la vida
El ARN también puede actuar como una molécula hereditaria, lo que alentó a Walter Gilbert a proponer que en un pasado lejano, la célula usaba ARN tanto como material genético como molécula estructural y catalítica en lugar de dividir estas funciones entre el ADN y la proteína como lo son hoy; esta hipótesis se conoce como la " hipótesis del mundo ARN " del origen de la vida . [22] Dado que los nucleótidos y el ARN y, por lo tanto, las ribozimas pueden surgir por sustancias químicas inorgánicas, son candidatos para las primeras enzimas y, de hecho, los primeros "replicadores", es decir, macromoléculas que contienen información que se replican a sí mismas. En 2002 se describió un ejemplo de una ribozima autorreplicante que liga dos sustratos para generar una copia exacta de sí misma. [23] El descubrimiento de la actividad catalítica del ARN resolvió la paradoja del "huevo y la gallina" del origen de la vida, resolviendo el problema del origen del dogma central de péptidos y ácidos nucleicos. De acuerdo con este escenario, en la vida más temprana, toda la actividad enzimática y la codificación de la información genética la realizaba una molécula, el ARN.
Ribozimas artificiales
Desde el descubrimiento de las ribozimas que existen en los organismos vivos, ha habido interés en el estudio de nuevas ribozimas sintéticas elaboradas en el laboratorio. Por ejemplo, se han producido ARN autoescindibles producidos artificialmente que tienen una buena actividad enzimática. Tang y Breaker [24] aislaron ARN autoescindibles mediante selección in vitro de ARN que se originaban a partir de ARN de secuencia aleatoria. Algunas de las ribozimas sintéticas que se produjeron tenían estructuras novedosas, mientras que otras eran similares a la ribozima cabeza de martillo de origen natural. En 2015, investigadores de la Universidad Northwestern y la Universidad de Illinois en Chicago diseñaron un ribosoma anclado que funciona casi tan bien como el auténtico componente celular que produce todas las proteínas y enzimas dentro de la célula. Llamado Ribosome-T , o Ribo-T, el ribosoma artificial fue creado por Michael Jewett y Alexander Mankin. [25] Las técnicas utilizadas para crear ribozimas artificiales implican evolución dirigida. Este enfoque aprovecha la naturaleza dual del ARN como catalizador y como polímero informativo, lo que facilita que un investigador produzca grandes poblaciones de catalizadores de ARN utilizando enzimas polimerasas . Las ribozimas se mutan mediante transcripción inversa con transcriptasa inversa en varios ADNc y se amplifican con PCR propensa a errores . Los parámetros de selección en estos experimentos a menudo difieren. Un enfoque para seleccionar una ligasa ribozima implica el uso de etiquetas de biotina , que están unidas covalentemente al sustrato. Si una molécula posee la actividad ligasa deseada , se puede usar una matriz de estreptavidina para recuperar las moléculas activas.
Lincoln y Joyce desarrollaron un sistema de enzimas de ARN capaz de autorreplicarse en aproximadamente una hora. Al utilizar la competencia molecular ( evolución in vitro ) de una mezcla de ARN candidata, surgió un par de ribozimas, en las que cada una sintetiza la otra uniendo oligonucleótidos sintéticos, sin proteína presente. [26]
Aunque no son verdaderos catalizadores, la creación de ribointerruptores artificiales autodescindibles, denominados aptazimas, también ha sido un área activa de investigación. Los ribosconmutadores son motivos de ARN reguladores que cambian su estructura en respuesta a un ligando de molécula pequeña para regular la traducción. Si bien existen muchos riboconmutadores naturales conocidos que se unen a una amplia gama de metabolitos y otras moléculas orgánicas pequeñas, solo se ha descrito una ribozima basada en un riboconmutador , glmS . [27] El trabajo inicial en la caracterización de los riboconmutadores autoescindibles se centró en el uso de teofilina como ligando. En estos estudios se forma una horquilla de ARN que bloquea el sitio de unión del ribosoma , inhibiendo así la traducción. En presencia del ligando , en estos casos teofilina, la región reguladora del ARN se escinde, lo que permite que el ribosoma se una y traduzca el gen diana. Gran parte de este trabajo de ingeniería de ARN se basó en un diseño racional y estructuras de ARN previamente determinadas en lugar de evolución dirigida como en los ejemplos anteriores. Un trabajo más reciente ha ampliado los ligandos utilizados en los riboconmutadores de ribozima para incluir pirofosfato de timina (2). La clasificación de células activadas por fluorescencia también se ha utilizado para diseñar aptazimas. [28]
RNA polimerasa ribozima
Se cree que la vida moderna, basada en gran parte en el ADN como material genético, desciende de organismos basados en ARN en un mundo de ARN anterior . La vida del ARN habría dependido de una ribozima de ARN polimerasa dependiente de ARN para copiar moléculas de ARN funcionales, incluida la copia de la propia polimerasa. Tjhung y col. [29] han obtenido una ribozima de ARN polimerasa por evolución in vitro que tiene un nivel de actividad sin precedentes en la copia de moléculas complejas de ARN. Sin embargo, esta ribozima no puede copiarse a sí misma y sus productos de ARN tienen una alta tasa de mutación . No obstante, se sigue avanzando hacia el objetivo de obtener, mediante evolución in vitro , una ribozima ARN polimerasa auto-reproductora precisa y eficaz para mejorar la comprensión de la evolución temprana de la vida.
Samanta y Joyce [30] encontraron que una ribozima polimerasa de ARN altamente evolucionada podía funcionar como una transcriptasa inversa , es decir, puede sintetizar una copia de ADN utilizando una plantilla de ARN. Se considera que dicha actividad ha sido crucial para la transición de genomas de ARN a ADN durante la historia temprana de la vida en la tierra. La capacidad de transcripción inversa podría haber surgido como una función secundaria de una ribozima polimerasa de ARN dependiente temprana de ARN.
Aplicaciones
Se han propuesto y desarrollado ribozimas para el tratamiento de enfermedades mediante terapia génica (3). Uno de los principales desafíos del uso de enzimas basadas en ARN como terapéutico es la corta vida media de las moléculas de ARN catalíticas en el cuerpo. Para combatir esto, la posición 2 'de la ribosa se modifica para mejorar la estabilidad del ARN. Un área de la terapia génica con ribozimas ha sido la inhibición de virus basados en ARN.
Se ha desarrollado un tipo de ribozima sintética dirigida contra el ARN del VIH, denominada cizalla genética, que ha entrado en pruebas clínicas para detectar la infección por VIH. [31] [32]
De manera similar, las ribozimas se han diseñado para atacar el ARN del virus de la hepatitis C, el coronavirus del SARS (SARS-CoV), [33] adenovirus [33] y el ARN de los virus de la influenza A y B. [34] [35] [36] [33] La ribozima es capaz de escindir las regiones conservadas del genoma del virus, lo que ha demostrado reducir el virus en cultivos de células de mamíferos. [37] A pesar de estos esfuerzos de los investigadores, estos proyectos se han mantenido en la etapa preclínica.
Ribozimas conocidas
Clases de ribozimas naturales bien validadas:
- Ribozima ramificada GIR1 [38]
- ribozima glmS
- Intrón auto-empalmado del grupo I
- Grupo II auto-empalme intrón - Spliceosome es probable que deriva de ribozimas libre de empalme del Grupo II. [39]
- Ribozima horquilla
- Ribozima cabeza de martillo
- Ribozima HDV
- ARNr : se encuentra en todas las células vivas y une los aminoácidos para formar proteínas .
- RNasa P
- Twister ribozima
- Twister hermana ribozima
- VS ribozima
- Ribozima de pistola
- Ribozima de hacha
- Viroides
Ver también
- Desoxirribozima
- Monstruo de Spiegelman
- Catálisis
- Enzima
- Hipótesis mundial de ARN
- Ácido nucleico peptídico
- Análogos de ácidos nucleicos
- Hipótesis mundial de PAH
- SELEX
- ARN OLE
notas y referencias
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Otras lecturas
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enlaces externos
- Charla corta de Tom Cech: "Descubriendo las ribozimas"