La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con estructura química definida ( secuencia ). La técnica es extremadamente útil en la práctica de laboratorio actual porque proporciona un acceso rápido y económico a oligonucleótidos personalizados de la secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN solo en una dirección 5 'a 3' , la síntesis química de oligonucleótidos no tiene esta limitación, aunque con mayor frecuencia se lleva a cabo en la dirección opuesta, 3 'a 5'. Actualmente, el proceso se implementa como síntesis en fase sólida utilizando fosforamidita.método y bloques de construcción de fosforamidita derivados de 2'-desoxinucleósidos protegidos ( dA , dC , dG y T ), ribonucleósidos ( A , C , G y U ) o nucleósidos modificados químicamente, por ejemplo, LNA o BNA .
Para obtener el oligonucleótido deseado, los bloques de construcción se acoplan secuencialmente a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto (ver Ciclo sintético a continuación). El proceso ha sido completamente automatizado desde finales de la década de 1970. Una vez completado el montaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recoge. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótidos ) porque el número de errores se acumula con la longitud del oligonucleótido que se sintetiza. [1] Los productos a menudo se aíslan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para obtener los oligonucleótidos deseados con alta pureza. Por lo general, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de ADN o ARN monocatenarias de alrededor de 15 a 25 bases de longitud.
Los oligonucleótidos encuentran una variedad de aplicaciones en biología molecular y medicina. Se utilizan con mayor frecuencia como oligonucleótidos antisentido , ARN interferente pequeño , cebadores para la secuenciación y amplificación del ADN , sondas para detectar ADN o ARN complementario mediante hibridación molecular , herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción , y para la síntesis de genes artificiales .
Historia
La evolución de la síntesis de oligonucleótidos vio cuatro métodos principales de formación de enlaces internucleosídicos y se ha revisado en la literatura con gran detalle. [2] [3] [4]
Trabajo temprano y síntesis contemporánea de H-fosfonato
A principios de la década de 1950, el grupo de Alexander Todd fue pionero en los métodos de síntesis de oligonucleótidos de triéster de fosfonato y fosfato . [5] [6] La reacción de los compuestos 1 y 2 para formar el diéster 3 de H-fosfonato es un acoplamiento de H-fosfonato en solución mientras que la de los compuestos 4 y 5 para dar 6 es un acoplamiento de fosfotriéster (ver la síntesis de fosfotriéster a continuación).
Treinta años después, este trabajo inspiró, de forma independiente, a dos grupos de investigación a adoptar la química del H-fosfonato a la síntesis en fase sólida utilizando monoésteres de nucleósido H-fosfonato 7 como componentes básicos y cloruro de pivaloilo, cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo (TPS). -Cl), y otros compuestos como activadores. [7] [8] La implementación práctica del método de H-fosfonato resultó en un ciclo sintético muy corto y simple que constaba de solo dos pasos, detritilación y acoplamiento (Esquema 2). La oxidación de enlaces diéster de H-fosfonato internucleosídico en 8 a enlaces fosfodiéster en 9 con una solución de yodo en piridina acuosa se lleva a cabo al final del ensamblaje de la cadena en lugar de como un paso en el ciclo sintético. Si se desea, la oxidación se puede realizar en condiciones anhidras. [9] Alternativamente, 8 se puede convertir en fosforotioato 10 [10] [11] [12] [13] o fosforoselenoato 11 (X = Se), [14] o se puede oxidar por CCl 4 en presencia de aminas primarias o secundarias para análogos de fosforamidato 12 . [15] [16] El método es muy conveniente porque se pueden introducir varios tipos de modificaciones de fosfato (fosfato / fosforotioato / fosforamidato) en el mismo oligonucleótido para modular sus propiedades. [17] [18] [19]
Muy a menudo, los bloques de construcción de H-fosfonato están protegidos en el grupo 5'-hidroxi y en el grupo amino de las bases nucleicas A, C y G de la misma manera que los bloques de construcción de fosforamidita (ver más adelante). Sin embargo, la protección en el grupo amino no es obligatoria. [9] [20]
Síntesis de fosfodiéster
En la década de 1950, Har Gobind Khorana y sus colaboradores desarrollaron un método de fosfodiéster en el que se activaba 3'- O -acetilnucleósido-5'- O -fosfato 2 (Esquema 3) con N , N ' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) o 4-toluenosulfonilo cloruro (Ts-Cl). Las especies activadas se hicieron reaccionar con un nucleósido 1 protegido en 5'- O para dar un monofosfato de dinucleósido 3 protegido . [21] Tras la eliminación del grupo 3'- O- acetilo usando hidrólisis catalizada por una base, se llevó a cabo un alargamiento adicional de la cadena. Siguiendo esta metodología, se sintetizaron conjuntos de tri- y tetradesoxirribonucleótidos y se convirtieron enzimáticamente en oligonucleótidos más largos, lo que permitió dilucidar el código genético . La principal limitación del método del fosfodiéster consistió en la formación de oligómeros pirofosfato y oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. El método parece ser un paso atrás de la química más selectiva descrita anteriormente; sin embargo, en ese momento, la mayoría de los grupos protectores de fosfato disponibles en la actualidad aún no se habían introducido. La falta de una estrategia de protección conveniente hizo necesario retroceder hacia una química más lenta y menos selectiva para lograr el objetivo final del estudio. [2]
Síntesis de fosfotriéster
En la década de 1960, grupos liderados por R. Letsinger [22] y C. Reese [23] desarrollaron un enfoque de fosfotriéster. La diferencia definitoria del enfoque del fosfodiéster fue la protección del resto fosfato en el bloque de construcción 1 (Esquema 4) y en el producto 3 con el grupo 2-cianoetilo . Esto impidió la formación de oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. La mayor selectividad del método permitió el uso de catalizadores y agentes de acoplamiento más eficientes, [24] [25] lo que redujo drásticamente la duración de la síntesis. El método, inicialmente desarrollado para la síntesis en fase de solución, también se implementó en poliestireno de "palomitas de maíz" de bajo reticulado, [26] y más tarde en vidrio de poro controlado (CPG, ver "Material de soporte sólido" más abajo), que inició una un esfuerzo de investigación masivo en la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida y finalmente condujo a la automatización del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos.
Síntesis de triéster de fosfito
En la década de 1970, se utilizaron con éxito derivados P (III) sustancialmente más reactivos de nucleósidos, 3'- O -clorofosfitos, para la formación de enlaces internucleosídicos. [27] Esto llevó al descubrimiento de la metodología triéster de fosfito . El grupo dirigido por M. Caruthers aprovechó la ventaja de los 1H -tetrazolidofosfitos menos agresivos y más selectivos e implementó el método en fase sólida. [28] Muy poco después, los trabajadores del mismo grupo mejoraron aún más el método utilizando fosforamiditas de nucleósidos más estables como bloques de construcción. [29] El uso de un grupo protector de 2-cianoetilfosfito [30] en lugar de un grupo metilo menos fácil de usar [31] [32] condujo a las fosforamiditas de nucleósidos que se usan actualmente en la síntesis de oligonucleótidos (ver los bloques de construcción de fosforamiditas a continuación). Muchas mejoras posteriores en la fabricación de bloques de construcción, sintetizadores de oligonucleótidos y protocolos sintéticos hicieron de la química de la fosforamidita un método de elección muy confiable y conveniente para la preparación de oligonucleótidos sintéticos. [1]
Síntesis por el método de la fosforamidita
Bloques de construcción
Fosforamiditos de nucleósidos
Como se mencionó anteriormente, los nucleótidos de origen natural (nucleósido-3'- o 5'-fosfatos) y sus análogos de fosfodiéster son insuficientemente reactivos para proporcionar una preparación sintética rápida de oligonucleótidos con altos rendimientos. La selectividad y la velocidad de formación de enlaces internucleosídicos se mejoran drásticamente mediante el uso de 3'- O - ( N , N- diisopropilfosforamidita) derivados de nucleósidos (nucleósidos fosforamiditos) que sirven como bloques de construcción en la metodología del triéster de fosfito. Para evitar reacciones secundarias no deseadas, todos los demás grupos funcionales presentes en los nucleósidos deben volverse no reactivos (protegidos) mediante la unión de grupos protectores . Una vez completado el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos, todos los grupos protectores se eliminan para producir los oligonucleótidos deseados. A continuación, se revisan brevemente los grupos protectores que se utilizan actualmente en [33] [34] [35] [36] y los bloques de construcción de nucleósidos fosforamiditos más comunes:
- El grupo 5'-hidroxilo está protegido por un grupo DMT (4,4'-dimetoxitritilo) lábil a los ácidos .
- La timina y el uracilo , bases nucleicas de timidina y uridina , respectivamente, no tienen grupos amino exocíclicos y, por tanto, no requieren ninguna protección.
- Aunque la base nucleica de guanosina y 2'-desoxiguanosina tiene un grupo amino exocíclico, su basicidad es baja hasta el punto de que no reacciona con las fosforamiditas en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Sin embargo, una fosforamidita derivada de la 5'- O -DMT-2'-desoxiguanosina no protegida en N2 es poco soluble en acetonitrilo , el disolvente comúnmente utilizado en la síntesis de oligonucleótidos. [37] Por el contrario, las versiones protegidas con N2 del mismo compuesto se disuelven bien en acetonitrilo y, por lo tanto, se utilizan ampliamente. Las bases nucleicas adenina y citosina portan los grupos amino exocíclicos reactivos con las fosforamiditas activadas en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Mediante el uso de pasos adicionales en el ciclo sintético [38] [39] o agentes de acoplamiento alternativos y sistemas de disolventes, [37] el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos puede llevarse a cabo usando fosforamiditas dA y dC con grupos amino desprotegidos. Sin embargo, estos enfoques se encuentran actualmente en la etapa de investigación. En la síntesis de oligonucleótidos de rutina, los grupos amino exocíclicos en los nucleósidos se mantienen permanentemente protegidos en toda la longitud del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos.
La protección de los grupos amino exocíclicos tiene que ser ortogonal a la del grupo 5'-hidroxi porque este último se elimina al final de cada ciclo sintético. La estrategia más simple de implementar, y por lo tanto la más utilizada, es instalar un grupo de protección lábil en base a los grupos amino exocíclicos. Muy a menudo, se utilizan dos esquemas de protección.
- En el primero, el esquema estándar y más robusto (Figura), la protección Bz (benzoílo) se usa para A, dA, C y dC, mientras que G y dG están protegidos con el grupo isobutirilo. Más recientemente, el grupo Ac (acetilo) se usa para proteger C y dC como se muestra en la Figura. [40]
- En el segundo esquema de protección suave, A y dA están protegidos con grupos isobutirilo [41] o fenoxiacetilo (PAC). [42] C y dC tienen protección acetil, [40] y G y dG están protegidos con grupos 4-isopropilfenoxiacetil ( i Pr-PAC) [43] o dimetilformamidino (dmf) [44] . Los grupos protectores suaves se eliminan más fácilmente que los grupos protectores estándar. Sin embargo, las fosforamiditas que llevan estos grupos son menos estables cuando se almacenan en solución.
- El grupo fosfito está protegido por un grupo 2-cianoetilo lábil en base . [30] Una vez que se ha acoplado una fosforamidita al oligonucleótido unido al soporte sólido y los restos de fosfito se han convertido en la especie P (V), la presencia de la protección de fosfato no es obligatoria para la conducción exitosa de reacciones de acoplamiento adicionales. [45]
- En la síntesis de ARN, el grupo 2'-hidroxi está protegido con el grupo TBDMS ( t -butildimetilsililo). [46] [47] [48] [49] o con TOM (tri- iso grupo -propylsilyloxymethyl), [50] [51] siendo ambos extraíble por tratamiento con ion fluoruro.
- El resto fosfito también porta un grupo diisopropilamino ( i Pr 2 N) reactivo en condiciones ácidas. Tras la activación, el grupo diisopropilamino deja de ser sustituido por el grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido unido al soporte (ver "Paso 2: Acoplamiento" más adelante).
Fosforamiditas no nucleósidos
Las fosforamiditas no nucleósido son los reactivos de fosforamidita diseñados para introducir diversas funcionalidades en los extremos de los oligonucleótidos sintéticos o entre los residuos de nucleótidos en el medio de la secuencia. Para ser introducido dentro de la secuencia, un modificador no nucleosídico tiene que poseer al menos dos grupos hidroxi, uno de los cuales a menudo está protegido con el grupo DMT mientras que el otro lleva el resto fosforamidita reactivo.
Las fosforamiditas no nucleosídicas se utilizan para introducir grupos deseados que no están disponibles en los nucleósidos naturales o que pueden introducirse más fácilmente utilizando diseños químicos más simples. En el Esquema se muestra una selección muy corta de reactivos de fosforamidita comerciales para la demostración de la diversidad estructural y funcional disponible. Estos reactivos sirven para la unión de fosfato 5'-terminal ( 1 ), [52] NH 2 ( 2 ), [53] SH ( 3 ), [54] aldehído ( 4 ), [55] y grupos carboxílicos ( 5 ) , [56] CC triples enlaces ( 6 ), [57] marcadores no radiactivos y extintores (ejemplificados por 6-FAM amidita 7 [58] para la unión de fluoresceína y dabcil amidita 8 , [59] respectivamente), hidrófilos e hidrófobos modificadores (ejemplificados por hexaetilenglicol amidita 9 [60] [61] y colesterol amidita 10 , [62] respectivamente) y biotina amidita 11 . [63]
Ciclo de síntesis
La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo mediante la adición escalonada de residuos de nucleótidos al extremo 5 'de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia deseada. Cada adición se denomina ciclo de síntesis (esquema 5) y consta de cuatro reacciones químicas:
Paso 1: Desbloqueo (destritilación)
El grupo DMT se elimina con una solución de un ácido, como ácido tricloroacético (TCA) al 2% o ácido dicloroacético (DCA) al 3% , en un disolvente inerte ( diclorometano o tolueno ). El catión DMT de color naranja formado se elimina por lavado; el paso da como resultado que el precursor de oligonucleótido unido a un soporte sólido que lleva un grupo hidroxilo 5 'terminal libre. Vale la pena recordar que la destritilación durante un tiempo prolongado o con soluciones de ácidos más fuertes que las recomendadas conduce a la depurinación del oligonucleótido unido al soporte sólido y, por lo tanto, reduce el rendimiento del producto de longitud completa deseado.
Paso 2: acoplamiento
Una solución 0,02-0,2 M de fosforamidita de nucleósido (o una mezcla de varios fosforamiditas) en acetonitrilo se activa mediante una solución de 0,2-0,7 M de un ácido azol catalizador, 1 H -tetrazol , 5-etiltio-1H-tetrazol, [64] 2-benciltiotetrazol, [65] [66] 4,5-diciano imidazol , [67] o varios compuestos similares. En una revisión reciente se puede encontrar información más extensa sobre el uso de varios agentes de acoplamiento en la síntesis de oligonucleótidos. [68] La mezcla suele ser muy breve y ocurre en líneas fluidas de sintetizadores de oligonucleótidos (ver más abajo) mientras los componentes se entregan a los reactores que contienen soporte sólido. La fosforamidita activada en un exceso de 1,5 a 20 veces sobre el material unido al soporte se pone luego en contacto con el soporte sólido de partida (primer acoplamiento) o un precursor oligonucleotídico unido al soporte (después de los acoplamientos) cuyo grupo 5'-hidroxi reacciona con el resto de fosforamidita activada del nucleósido fosforamidita entrante para formar un enlace triéster de fosfito. El acoplamiento de las fosforamiditas de 2'-desoxinucleósido es muy rápido y requiere, a pequeña escala, aproximadamente 20 s para su finalización. Por el contrario, las fosforamiditas de ribonucleósido protegidas con 2'- O estéricamente impedidas requieren de 5 a 15 minutos para acoplarse con altos rendimientos. [47] [69] [70] [71] La reacción también es muy sensible a la presencia de agua, particularmente cuando se usan soluciones diluidas de fosforamiditas, y comúnmente se lleva a cabo en acetonitrilo anhidro. Generalmente, cuanto mayor es la escala de la síntesis, menor es el exceso y mayor es la concentración de fosforamiditas que se utiliza. Por el contrario, la concentración del activador está determinada principalmente por su solubilidad en acetonitrilo y es independiente de la escala de la síntesis. Una vez completado el acoplamiento, los reactivos y subproductos no unidos se eliminan mediante lavado.
Paso 3: taponado
La etapa de remate se realiza tratando el material unido al soporte sólido con una mezcla de anhídrido acético y 1-metilimidazol o, con menos frecuencia, DMAP como catalizadores y, en el método de la fosforamidita, tiene dos propósitos.
- Una vez completada la reacción de acoplamiento, un pequeño porcentaje de los grupos 5'-OH unidos al soporte sólido (0,1 a 1%) permanece sin reaccionar y debe bloquearse permanentemente para evitar un mayor alargamiento de la cadena para evitar la formación de oligonucleótidos con una base interna. deleción comúnmente conocida como (n-1) abreviaturas. Los grupos 5'-hidroxi que no han reaccionado son, en gran medida, acetilados por la mezcla de remate.
- También se ha informado de que fosforamiditas activan con 1 H -tetrazol reaccionar, en una pequeña medida, con la junta 6 posición de guanosina. [72] Tras la oxidación con I 2 / agua, este subproducto, posiblemente a través de la migración de O 6 -N7, se depuriza . Los sitios apurínicos así formados se escinden fácilmente en el transcurso de la desprotección final del oligonucleótido en las condiciones básicas (véase más adelante) para dar dos oligonucleótidos más cortos, reduciendo así el rendimiento del producto de longitud completa. Las modificaciones de O 6 se eliminan rápidamente mediante tratamiento con el reactivo de protección siempre que la etapa de protección se realice antes de la oxidación con I 2 / agua.
- La síntesis de fosforotioatos de oligonucleótidos (OPS, véase más adelante) no implica la oxidación con I 2 / agua y, respectivamente, no sufre la reacción secundaria descrita anteriormente. Por otro lado, si la etapa de protección se realiza antes de la sulfuración, el soporte sólido puede contener el anhídrido acético residual y el N-metilimidazol que queda después de la etapa de protección. La mezcla de protección interfiere con la reacción de transferencia de azufre, lo que da como resultado la formación extensa de enlaces internucleosídicos triéster de fosfato en lugar de los triésteres de PS deseados. Por lo tanto, para la síntesis de OPS, es aconsejable realizar el paso de sulfuración antes del paso de protección. [73]
Paso 4: oxidación
El enlace triéster de fosfito tricoordinado recién formado no es natural y tiene una estabilidad limitada en las condiciones de síntesis de oligonucleótidos. El tratamiento del material unido al soporte con yodo y agua en presencia de una base débil (piridina, lutidina o colidina ) oxida el triéster de fosfito en un triéster de fosfato tetracoordinado, un precursor protegido del enlace internucleosídico de diéster de fosfato natural. La oxidación se puede llevar a cabo en condiciones anhidras usando hidroperóxido de terc-butilo [74] o, más eficazmente, (1S) - (+) - (10-canforsulfonil) -oxaziridina (CSO). [75] [76] [77] El paso de oxidación puede sustituirse por un paso de sulfuración para obtener fosforotioatos de oligonucleótidos (consulte Fosforotioatos de oligonucleótidos y su síntesis a continuación). En el último caso, la etapa de sulfuración se lleva a cabo mejor antes del taponado.
Soportes sólidos
En la síntesis en fase sólida, un oligonucleótido que se ensambla se une covalentemente , a través de su grupo hidroxi en el extremo 3 ', a un material de soporte sólido y permanece unido a él durante todo el curso del ensamblaje de la cadena. El soporte sólido está contenido en columnas cuyas dimensiones dependen de la escala de síntesis y pueden variar entre 0.05 mL y varios litros. La inmensa mayoría de los oligonucleótidos se sintetizan a pequeña escala que van desde 10 n mol a 1 μmol. Más recientemente, la síntesis de oligonucleótidos de alto rendimiento en la que el soporte sólido está contenido en los pocillos de las placas de múltiples pocillos (más a menudo, 96 o 384 pocillos por placa) se convirtió en un método de elección para la síntesis paralela de oligonucleótidos a pequeña escala. [78] Al final del ensamblaje de la cadena, el oligonucleótido se libera del soporte sólido y se eluye de la columna o del pocillo.
Material de soporte sólido
A diferencia de la síntesis orgánica en fase sólida y la síntesis de péptidos , la síntesis de oligonucleótidos se produce mejor en soportes sólidos no hinchables o poco hinchables. Los dos materiales en fase sólida más utilizados son el vidrio de poro controlado (CPG) y el poliestireno macroporoso (MPPS). [79]
- La CPG se define comúnmente por el tamaño de sus poros. En la química de los oligonucleótidos, se utilizan tamaños de poro de 500, 1000, 1500, 2000 y 3000 Å para permitir la preparación de oligonucleótidos de aproximadamente 50, 80, 100, 150 y 200 mer, respectivamente. Para hacer que la CPG nativa sea adecuada para procesamiento adicional, la superficie del material se trata con (3-aminopropil) trietoxisilano para dar aminopropil CPG. El brazo de aminopropilo se puede extender más para dar como resultado CPG de aminoalquilo de cadena larga (LCAA). El grupo amino se usa luego como un punto de anclaje para enlazadores adecuados para la síntesis de oligonucleótidos (ver más abajo).
- El MPPS adecuado para la síntesis de oligonucleótidos es un poliestireno altamente reticulado y poco hinchable obtenido por polimerización de divinilbenceno (mínimo 60%), estireno y 4- clorometilestireno en presencia de un agente porógeno. El clorometil MPPS macroporoso obtenido se convierte en aminometil MPPS.
Química del enlazador
Para hacer que el material de soporte sólido sea adecuado para la síntesis de oligonucleótidos, se unen covalentemente enlazadores no nucleosídicos o succinatos de nucleósido a los grupos amino reactivos en aminopropil CPG, LCAA CPG o aminometil MPPS. Los grupos amino restantes que no han reaccionado se protegen con anhídrido acético . Normalmente, se utilizan tres grupos conceptualmente diferentes de soportes sólidos.
- Soportes universales . En un método más reciente, más conveniente y más ampliamente utilizado, la síntesis comienza con el soporte universal donde se une un enlazador no nucleosídico al material de soporte sólido (compuestos 1 y 2 ). Una fosforamidita respectiva al residuo de nucleósido del extremo 3 'se acopla al soporte sólido universal en el primer ciclo sintético de ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos usando los protocolos estándar. A continuación, se continúa el ensamblaje de la cadena hasta que se completa, después de lo cual se desprotege el oligonucleótido unido al soporte sólido. El rasgo característico de los soportes sólidos universales es que la liberación de los oligonucleótidos ocurre por la escisión hidrolítica de un enlace PO que une el 3'- O del residuo de nucleótido 3'-terminal al enlazador universal como se muestra en el Esquema 6. El La ventaja crítica de este enfoque es que se usa el mismo soporte sólido independientemente de la secuencia del oligonucleótido que se va a sintetizar. Para la eliminación completa del enlazador y el fosfato del extremo 3 'del oligonucleótido ensamblado, el soporte sólido 1 y varios soportes sólidos similares [80] requieren amoníaco gaseoso, [81] hidróxido de amonio acuoso, metilamina acuosa, [82] o sus mezcla [83] y están disponibles comercialmente. [84] [85] El soporte sólido 2 [86] requiere una solución de amoníaco en metanol anhidro y también está disponible comercialmente. [87] [88]
- Soportes sólidos nucleosídicos . En un enfoque históricamente primero y todavía popular, el grupo 3'-hidroxi del residuo de nucleósido 3'-terminal se une al soporte sólido a través, más a menudo, del brazo 3'- O- succinilo como en el compuesto 3 . El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos comienza con el acoplamiento de un bloque de construcción de fosforamidita respectivo al segundo residuo de nucleótido desde el extremo 3 '. El grupo hidroxi 3 'terminal en oligonucleótidos sintetizados sobre soportes sólidos nucleosídicos se desprotege en condiciones algo más suaves que las aplicables para soportes sólidos universales. Sin embargo, el hecho de que un soporte sólido nucleosídico tenga que seleccionarse de una manera específica de secuencia reduce el rendimiento de todo el proceso sintético y aumenta la probabilidad de error humano.
- Se utilizan soportes sólidos especiales para la unión de grupos indicadores o funcionales deseados en el extremo 3 'de los oligonucleótidos sintéticos. Por ejemplo, el soporte sólido comercial [89] 4 [90] permite la preparación de oligonucleótidos que portan un conector 3-aminopropilo 3'-terminal. De manera similar a las fosforamiditas no nucleosídicas, están disponibles comercialmente muchos otros soportes sólidos especiales diseñados para la unión de grupos funcionales reactivos, grupos indicadores no radiactivos y modificadores terminales ( colesterol ec u otras ataduras hidrófobas) y adecuados para diversas aplicaciones. En una revisión reciente se puede encontrar información más detallada sobre varios soportes sólidos para la síntesis de oligonucleótidos. [78]
Fosforotioatos de oligonucleótidos y su síntesis
Los fosforotioatos de oligonucleótidos (OPS) son oligonucleótidos modificados en los que uno de los átomos de oxígeno en el resto de fosfato se reemplaza por azufre. Sólo los fosforotioatos que tienen azufre en una posición sin puente, como se muestra en la figura, se utilizan ampliamente y están disponibles comercialmente. El reemplazo del oxígeno no puente por azufre crea un nuevo centro de quiralidad en el fósforo . En un caso simple de un dinucleótido, esto da como resultado la formación de un par diastereomérico de monofosforotioatos de dinucleósidos S p - y R p - cuyas estructuras se muestran en la Figura. En un oligonucleótido n- mero en el que todos ( n - 1) enlaces internucleosídicos son enlaces fosforotioato, el número de diastereómeros m se calcula como m = 2 ( n - 1) . Al ser análogos no naturales de los ácidos nucleicos, los OPS son sustancialmente más estables frente a la hidrólisis por nucleasas , la clase de enzimas que destruyen los ácidos nucleicos al romper el enlace PO de puente del resto fosfodiéster. Esta propiedad determina el uso de OPS como oligonucleótidos antisentido en aplicaciones in vitro e in vivo donde la exposición extensa a nucleasas es inevitable. De manera similar, para mejorar la estabilidad del ARNip , a menudo se introduce al menos un enlace fosforotioato en el extremo 3 'de las cadenas tanto sentido como antisentido. En OPS quiralmente puro, los diastereómeros todo-Sp son más estables a la degradación enzimática que sus análogos todo-Rp. [91] Sin embargo, la preparación de OPS quiralmente puro sigue siendo un desafío sintético. [13] [92] En la práctica de laboratorio, se utilizan comúnmente mezclas de diastereómeros de OPS.
La síntesis de OPS es muy similar a la de los oligonucleótidos naturales. La diferencia es que la etapa de oxidación se reemplaza por la reacción de transferencia de azufre (sulfuración) y que la etapa de protección se realiza después de la sulfuración. De muchos reactivos reportados capaces de la transferencia eficiente de azufre, solo tres están disponibles comercialmente:
- 3- (dimetilaminometilideno) amino-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona, DDTT ( 3 ) proporciona una cinética rápida de sulfuración y alta estabilidad en solución. [73] [93] [94] El reactivo está disponible en varias fuentes. [95] [96]
- 3 H -1,2-benzoditiol-3-ona 1,1-dióxido ( 4 ) [97] [98] también conocido como pantallas reactivo de Beaucage una mejor solubilidad en acetonitrilo y de reacción corto veces. Sin embargo, el reactivo tiene una estabilidad limitada en solución y es menos eficaz para sulfurar enlaces de ARN. [93] [94]
- El disulfuro de N, N, N'N '- tetraetiltiuram (TETD) es soluble en acetonitrilo y está disponible comercialmente. [99] Sin embargo, la reacción de sulfuración de un enlace de ADN internucleosídico con TETD requiere 15 min, [100] que es más de 10 veces más lenta que la de los compuestos 3 y 4 .
Automatización
En el pasado, la síntesis de oligonucleótidos se realizaba manualmente en solución o en fase sólida. La síntesis en fase sólida se implementó utilizando, como contenedores para la fase sólida, columnas de vidrio en miniatura similares en su forma a columnas de cromatografía de baja presión o jeringas equipadas con filtros porosos. [101] Actualmente, la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida se lleva a cabo automáticamente utilizando instrumentos controlados por computadora (sintetizadores de oligonucleótidos) y se implementa técnicamente en formatos de columna, placa de múltiples pocillos y matriz. El formato de columna es el más adecuado para investigación y aplicaciones a gran escala donde no se requiere un alto rendimiento. [102] El formato de placa de múltiples pocillos está diseñado específicamente para síntesis de alto rendimiento a pequeña escala para satisfacer la creciente demanda de oligonucleótidos sintéticos de la industria y el mundo académico. [103] Varios sintetizadores de oligonucleótidos para síntesis a pequeña escala [104] [105] [106] [107] [108] [109] y síntesis de mediana a gran escala [110] están disponibles comercialmente.
Primeros sintetizadores de oligonucleótidos disponibles comercialmente
En marzo de 1982, el Departamento de Bioquímica de la Technische Hochschule Darmstadt, Alemania, organizó un curso práctico. Asistieron MH Caruthers, MJ Gait, HG Gassen, H. Koster, K. Itakura y C. Birr, entre otros. El programa comprendió trabajo práctico, conferencias y seminarios sobre síntesis química de oligonucleótidos en fase sólida. Un selecto grupo de 15 estudiantes asistió y tuvo una oportunidad sin precedentes de ser instruidos por el estimado personal docente.
Junto con los ejercicios manuales, varias destacadas empresas de automatización asistieron al curso. Biosearch de Novato, CA, Genetic Design de Watertown, MA, fueron dos de varias empresas que demostraron sintetizadores automatizados en el curso. Biosearch presentó su nuevo sintetizador SAM I. The Genetic Design había desarrollado su sintetizador a partir del diseño de sus empresas hermanas (Sequemat) secuenciador de péptidos en fase sólida. The Genetic Design arregló con el Dr. Christian Birr (Instituto Max-Planck de Investigación Médica) [1] una semana antes del evento para convertir su secuenciador de fase sólida en el sintetizador semiautomático. El equipo dirigido por el Dr. Alex Bonner y Rick Neves convirtió la unidad y la transportó a Darmstadt para el evento y la instaló en el laboratorio de bioquímica de la Technische Hochschule. Como el sistema era semiautomático, el usuario inyectaba la siguiente base para agregar a la secuencia de cultivo durante cada ciclo. El sistema funcionó bien y produjo una serie de tubos de ensayo llenos de color rojo brillante de tritilo que indica un acoplamiento completo en cada paso. Posteriormente, este sistema se automatizó por completo mediante la inclusión de un autoinyector y se denominó Modelo 25A.
Historia de la síntesis de oligonucleótidos a mediana y gran escala
Los sintetizadores de oligonucleótidos a gran escala se desarrollaron a menudo aumentando las capacidades de una plataforma de instrumentos preexistente. Uno de los primeros sintetizadores de escala media apareció a fines de la década de 1980, fabricado por la compañía Biosearch en Novato, CA (The 8800). Esta plataforma se diseñó originalmente como un sintetizador de péptidos y utilizó un reactor de lecho fluidizado esencial para adaptarse a las características de hinchamiento de los soportes de poliestireno utilizados en la metodología Merrifield. La síntesis de oligonucleótidos implicó el uso de CPG (vidrio de poro controlado) que es un soporte rígido y es más adecuado para reactores de columna como se describió anteriormente. La escala del 8800 se limitó al caudal requerido para fluidizar el soporte. Algunos diseños de reactores novedosos, así como presiones más altas de lo normal, permitieron al 8800 lograr escalas que prepararían 1 mmol de oligonucleótido. A mediados de la década de 1990, varias empresas desarrollaron plataformas basadas en cromatógrafos de líquidos semipreparativos y preparativos. Estos sistemas eran muy adecuados para un enfoque de reactor de columna. En la mayoría de los casos, todo lo que se requería era aumentar la cantidad de fluidos que se podían suministrar a la columna. La síntesis de oligonucleótidos requiere un mínimo de 10 y los cromatógrafos de líquidos suelen acomodar 4. Esta fue una tarea de diseño fácil y algunas estrategias semiautomáticas funcionaron sin ninguna modificación al equipo LC preexistente. PerSeptive Biosystems y Pharmacia (GE) fueron dos de varias empresas que desarrollaron sintetizadores a partir de cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. [111] fue una de las pocas empresas en desarrollar un sintetizador de oligonucleótidos a gran escala que fue, desde cero, un sintetizador de oligonucleótidos. La plataforma inicial llamada VLSS para sintetizadores a gran escala utilizaba grandes columnas de cromatógrafo de líquidos de Pharmacia como reactores y podía sintetizar hasta 75 milimoles de material. Muchas fábricas de síntesis de oligonucleótidos diseñaron y fabricaron sus propias plataformas personalizadas y se sabe poco debido a que los diseños son propietarios. El diseño de VLSS continuó perfeccionándose y continúa en el sintetizador QMaster [112], que es una plataforma reducida que proporciona cantidades de miligramos a gramos de oligonucleótidos sintéticos.
Recientemente se han revisado las prácticas actuales de síntesis de oligonucleótidos químicamente modificados a gran escala. [113]
Síntesis de microarrays de oligonucleótidos
Se puede visualizar una micromatriz de oligonucleótidos como una placa de múltiples pocillos en miniatura donde los divisores físicos entre los pozos (paredes de plástico) se eliminan intencionalmente. Con respecto a la química, la síntesis de microarrays de oligonucleótidos es diferente de la síntesis de oligonucleótidos convencional en dos aspectos:
- Los oligonucleótidos permanecen unidos de forma permanente a la fase sólida, lo que requiere el uso de enlazadores que sean estables en las condiciones del procedimiento de desprotección final.
- La ausencia de divisores físicos entre los sitios ocupados por oligonucleótidos individuales, un espacio muy limitado en la superficie de la micromatriz (una secuencia de oligonucleótidos ocupa un cuadrado de 25 × 25 μm) [114] y el requisito de alta fidelidad de la síntesis de oligonucleótidos dictan el uso de técnicas de desprotección 5 'selectivas de sitio. En un enfoque, la eliminación del grupo 5'- O -DMT se efectúa mediante la generación electroquímica del ácido en los sitios requeridos. [115] Otro enfoque utiliza el grupo protector 5'- O- (α-metil-6-nitropiperoniloxicarbonilo) (MeNPOC), que puede eliminarse mediante irradiación con luz UV de longitud de onda de 365 nm. [114]
Procesamiento post-sintético
Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el oligonucleótido unido al soporte sólido está completamente protegido:
- El grupo 5'-terminal 5'-hidroxi está protegido con el grupo DMT;
- Los restos de fosfato o fosforotioato internucleosídicos están protegidos con grupos 2-cianoetilo;
- Los grupos amino exocíclicos en todas las bases nucleicas excepto T y U están protegidos con grupos protectores de acilo.
Para proporcionar un oligonucleótido funcional, deben eliminarse todos los grupos protectores. La protección de base de N-acilo y la protección de fosfato de 2-cianoetilo pueden eliminarse, ya menudo se eliminan simultáneamente mediante tratamiento con bases inorgánicas o aminas. Sin embargo, la aplicabilidad de este método está limitada por el hecho de que la escisión de la protección de fosfato de 2-cianoetilo da lugar a acrilonitrilo como subproducto. Bajo las fuertes condiciones básicas requeridas para la eliminación de la protección de N-acilo, el acrilonitrilo es capaz de alquilación de bases nucleicas, principalmente, en la posición N3 de los residuos de timina y uracilo para dar los respectivos aductos de N3- (2-cianoetilo) a través de Michael. reacción . La formación de estos productos secundarios puede evitarse tratando los oligonucleótidos unidos al soporte sólido con soluciones de bases en un disolvente orgánico, por ejemplo, con trietilamina al 50% en acetonitrilo [116] o dietilamina al 10% en acetonitrilo. [117] Este tratamiento se recomienda encarecidamente para preparaciones a mediana y gran escala y es opcional para síntesis a pequeña escala donde la concentración de acrilonitrilo generado en la mezcla de desprotección es baja.
Independientemente de si los grupos protectores de fosfato se eliminaron primero, los oligonucleótidos unidos al soporte sólido se desprotegen usando uno de los dos enfoques generales.
- (1) Muy a menudo, el grupo 5'-DMT se elimina al final del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos. A continuación, los oligonucleótidos se liberan de la fase sólida y se desprotegen (base y fosfato) mediante tratamiento con hidróxido de amonio acuoso , metilamina acuosa , sus mezclas, [40] amoníaco o metilamina gaseosa [118] o, con menos frecuencia, soluciones de otras aminas primarias o álcalis a temperatura ambiente o elevada. Esto elimina todos los grupos de protección restantes de los 2'-desoxioligonucleótidos, lo que da como resultado una mezcla de reacción que contiene el producto deseado. Si el oligonucleótido contiene cualquier residuo de ribonucleótido protegido en 2'- O , el protocolo de desprotección incluye el segundo paso en el que los grupos sililo que protegen en 2'- O se eliminan mediante tratamiento con ion fluoruro mediante varios métodos. [119] El producto completamente desprotegido se usa tal cual, o el oligonucleótido deseado se puede purificar mediante varios métodos. Más comúnmente, el producto crudo se desala usando precipitación con etanol , cromatografía de exclusión por tamaño o HPLC de fase inversa . Para eliminar los productos de truncamiento no deseados, los oligonucleótidos se pueden purificar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o HPLC de intercambio aniónico seguido de desalación.
- (2) El segundo enfoque solo se utiliza cuando el método de purificación previsto es HPLC de fase inversa . En este caso, el grupo DMT del extremo 5 'que sirve como asa hidrófoba para la purificación se mantiene al final de la síntesis. El oligonucleótido se desprotege en condiciones básicas como se describió anteriormente y, tras la evaporación, se purifica mediante HPLC de fase inversa. A continuación, el material recogido se destritila en condiciones ácidas acuosas. A pequeña escala (menos de 0,01 a 0,02 mmol), a menudo se utiliza el tratamiento con ácido acético acuoso al 80% durante 15 a 30 min a temperatura ambiente, seguido de la evaporación de la mezcla de reacción a sequedad al vacío . Finalmente, el producto se desala como se describió anteriormente.
- Para algunas aplicaciones, se pueden unir grupos informadores adicionales a un oligonucleótido usando una variedad de procedimientos post-sintéticos.
Caracterización
Como con cualquier otro compuesto orgánico, es prudente caracterizar los oligonucleótidos sintéticos tras su preparación. En casos más complejos (investigación y síntesis a gran escala) los oligonucleótidos se caracterizan después de su desprotección y después de su purificación. Aunque el enfoque definitivo para la caracterización es la secuenciación , un procedimiento rutinario y relativamente económico, las consideraciones de reducción de costes excluyen su uso en la fabricación rutinaria de oligonucleótidos. En la práctica diaria, es suficiente obtener la masa molecular de un oligonucleótido registrando su espectro de masas . Actualmente se utilizan ampliamente dos métodos para la caracterización de oligonucleótidos: espectrometría de masas por electropulverización (ES MS) y espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización / desorción láser asistida por matriz ( MALDI-TOF ). Para obtener espectros informativos, es muy importante intercambiar todos los iones metálicos que puedan estar presentes en la muestra por iones de amonio o trialquilamonio [ ec trietilamonio, (C 2 H 5 ) 3 NH + ] antes de enviar una muestra al análisis, ya sea de los métodos.
- En el espectro ES MS, un oligonucleótido dado genera un conjunto de iones que corresponden a diferentes estados de ionización del compuesto. Así, el oligonucleótido con masa molecular M genera iones con masas (M - n H) / n donde M es la masa molecular del oligonucleótido en forma de ácido libre (todas las cargas negativas de los grupos fosfodiéster internucleosídicos se neutralizan con H + ) , n es el estado de ionización y H es la masa atómica del hidrógeno (1 Da ). Los más útiles para la caracterización son los iones con n que van de 2 a 5. El software suministrado con los instrumentos fabricados más recientemente es capaz de realizar un procedimiento de deconvolución , es decir, encuentra picos de iones que pertenecen al mismo conjunto y deriva la masa molecular de el oligonucleótido.
- Para obtener información más detallada sobre el perfil de impurezas de los oligonucleótidos, se utilizan cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS o HPLC-MS) [120] o espectrometría de masas por electroforesis capilar (CEMS) [121] .
Ver también
- Ácidos nucleicos
- Análogos de ácidos nucleicos
- Ácido nucleico peptídico
- Ácidos nucleicos puenteados
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