La ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) es un ARN no codificante que se encuentra en el virus de la hepatitis delta y que es necesario para la replicación viral y es el único virus humano conocido que utiliza la actividad de las ribozimas para infectar a su huésped. [1] La ribozima actúa para procesar las transcripciones de ARN a longitudes unitarias en una reacción de autoescisión durante la replicación del virus de la hepatitis delta, que se cree que se propaga mediante un mecanismo de doble círculo rodante. [2] [3] La ribozima es activa in vivo en ausencia de factores proteicos y era el ARN que se autoescindía de forma natural más rápida que se conoce en el momento de su descubrimiento. [4]
Ribozima del virus de la hepatitis delta | |
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Identificadores | |
Símbolo | HDV_ribozima |
Rfam | RF00094 |
Otros datos | |
Tipo de ARN | Gene ; ribozima |
Dominio (s) | Virus |
ENTONCES | Entonces: 0000374 |
Estructuras PDB | PDBe |
La estructura cristalina de esta ribozima se ha resuelto mediante cristalografía de rayos X y muestra cinco segmentos helicoidales conectados por un doble pseudonudo . [1]
Además del sentido (versión genómica), todos los virus HDV también tienen una versión antigenómica de la ribozima HDV. [5] Esta versión no es la secuencia complementaria exacta, pero adopta la misma estructura que la hebra de sentido (genómico). Las únicas diferencias "significativas" entre los dos son una pequeña protuberancia en el vástago P4 y una unión J4 / 2 más corta. Tanto las ribozimas genómicas como las antigenómicas son necesarias para la replicación. [2]
Ribozimas similares a HDV
La ribozima HDV está relacionada estructural y bioquímicamente con muchas otras ribozimas autodescindibles. Estas otras ribozimas a menudo se denominan ejemplos de ribozimas HDV, debido a estas similitudes, aunque no se encuentran en los virus de la hepatitis delta. También pueden denominarse "similares a HDV" para indicar este hecho. [6]
Las ribozimas de tipo HDV incluyen la ribozima CPEB3 de mamífero , miembros de retrotransposones (por ejemplo, en el elemento R2 RNA en insectos y en L1Tc y probablemente otros retrotransposones en tripanosomátidos) y secuencias de bacterias. [7] [8] [6] [9] [10] El agrupamiento es probablemente el resultado de una evolución convergente : los deltavirus que se encuentran fuera de los humanos también poseen una ribozima DV, y ningún escenario de transferencia horizontal de genes propuesto puede explicar esto todavía. [11] [12] [13]
Mecanismo de catálisis
La ribozima HDV cataliza la escisión del enlace fosfodiéster entre el nucleótido u oligonucleótido sustrato y el 5'-hidroxilo de la ribozima. En el virus de la hepatitis delta, esta secuencia de nucleótidos de sustrato comienza con uridina y se conoce como U (-1), sin embargo, la identidad del nucleótido -1 no cambia significativamente la velocidad de catálisis. [1] Solo hay un requisito para su naturaleza química, ya que como lo muestran Perrotta y Been, la sustitución de la U (-1) ribosa por desoxirribosa anula la reacción, lo cual es consistente con la predicción de que el 2′-hidroxilo es el nucleófilo en la reacción química. [14] Por lo tanto, a diferencia de muchas otras ribozimas, como la ribozima cabeza de martillo, la ribozima HDV no tiene requisitos en sentido ascendente para la catálisis y solo requiere un único ribonucleótido -1 como sustrato para reaccionar de manera eficiente. [1]
Inicialmente, se creía que el nucleótido 75 en la ribozima, una citosina conocida como C75, podía actuar como una base general con el N3 de C75 abstrayendo un protón del 2′-hidroxilo del nucleótido U (-1) para Facilitar el ataque nucleofílico sobre el enlace fosfodiéster. [1] Sin embargo, aunque está bien establecido que el N3 de C75 tiene un pKa perturbado de su valor normal de 4.45 y está más cerca de aproximadamente 6.15 o 6.40, [15] [16] no es lo suficientemente neutral para actuar como un catalizador base. En cambio, se cree que el N3 de C75 actúa como un ácido de Lewis para estabilizar el 5'-hidroxilo saliente de la ribozima; esto está respaldado por su proximidad al 5'-hidroxilo en la estructura cristalina. [1] [17] La sustitución del nucleótido C75 por cualquier otro nucleótido anula o deteriora sustancialmente la actividad de la ribozima, aunque esta actividad puede restaurarse parcialmente con imidazol, lo que implica además al C75 en la actividad catalítica. [18]
El C75 en la ribozima HDV ha sido objeto de varios estudios debido a su peculiar pKa. Los valores típicos de pKa para los nucleósidos libres oscilan entre 3,5 y 4,2; estos valores más bajos de pKa son ácidos y es poco probable que se vuelvan básicos. Sin embargo, es probable que el entorno estructural dentro de la ribozima, que incluye una hendidura del sitio activo desolvatado, proporcione un potencial electrostático negativo que podría perturbar el pKa de la citosina lo suficiente como para actuar como un ácido de Lewis. [19] [20] [21] [22]
Además de la estabilización con ácido de Lewis del grupo saliente 5'-hidroxilo, también se acepta ahora que la ribozima HDV puede usar un ión metálico para ayudar en la activación del 2'-hidroxilo para el ataque sobre el nucleótido U (-1). Un ión magnesio en el sitio activo de la ribozima está coordinado con el nucleófilo 2'-hidroxilo y un oxígeno del fosfato escindible, y puede actuar como un ácido de Lewis para activar el 2'-hidroxilo. [18] [17] Además, es posible que el fosfato de U23 pueda actuar como un ácido de Lewis para aceptar un protón del 2′-hidroxilo con el magnesio sirviendo como ión coordinador. [23] Debido a que la ribozima HDV no requiere iones metálicos para tener actividad, no es una metaloenzima obligada, pero la presencia de magnesio en el sitio activo mejora significativamente la reacción de escisión. La ribozima HDV parece tener un requerimiento inespecífico para que se plieguen cantidades bajas de cationes divalentes, siendo activa en Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ y Sr 2+ . [1] En ausencia de iones metálicos, parece probable que el agua pueda reemplazar el papel del magnesio como ácido de Lewis.
Regulación por ARN aguas arriba
Como está limitado por la naturaleza de auto-escisión rápida de la ribozima de HDV, los experimentos de ribonucleasa previos se realizaron en el producto 3 'de la auto-escisión en lugar del precursor. [24] Sin embargo, se sabe que la secuencia flanqueante participa en la regulación de la actividad de autoescisión de la ribozima del HDV. [25] [26] [27] Por lo tanto, la secuencia 5 'corriente arriba del sitio de autoescisión se ha incorporado para estudiar la actividad de autoescisión resultante de la ribozima HDV. [25] Se han identificado dos estructuras alternativas.
La primera estructura inhibidora está plegada por una transcripción extendida (es decir, transcripción -30/99, las coordenadas están referenciadas frente al sitio de autoescisión) que se extiende desde 30 nt aguas arriba del sitio de escisión hasta 15 nt aguas abajo del extremo 3 '. [25] La secuencia flanqueante secuestra la ribozima en una trampa cinética durante la transcripción y da como resultado una tasa de auto-escisión extremadamente disminuida. [25] Esta estructura que previene la auto-escisión incluye 3 tallos alternativos: Alt1, Alt2 y Alt3, que interrumpen la conformación activa. Alt1 es una interacción de largo alcance de 10 pb formada por un tramo inhibitorio aguas arriba (-25 / -15 nt) y el tramo aguas abajo (76/86 nt). [25] Alt1 interrumpe el tallo P2 en la conformación activa en la que se propone que P2 tenga un papel activador tanto para la ribozima genómica como para la antigenómica. [25] [28] [29] Alt2 es una interacción entre la secuencia flanqueante aguas arriba y la ribozima, y Alt3 es una interacción ribozima-ribozima no nativa. [25]
La estructura secundaria de esta conformación inhibidora está respaldada por varios enfoques experimentales. [25] En primer lugar, se realizó un sondeo directo a través de ribonucleasas y el modelado posterior a través de mfold 3.0 utilizando restricciones de los resultados del sondeo concuerda con la estructura propuesta. [25] En segundo lugar, se utilizó una serie de oligómeros de ADN complementarios a diferentes regiones de AS1 / 2 para rescatar la actividad de las ribozimas; los resultados confirman las funciones inhibidoras de AS1 / 2. [25] En tercer lugar, el análisis mutacional introduce mutaciones simples / dobles fuera de la ribozima para garantizar que la actividad de la ribozima observada esté directamente asociada con la estabilidad de Alt1. [25] Se encuentra que la estabilidad de AS1 está inversamente relacionada con la actividad de autoescisión. [25]
La segunda estructura permisiva permite que la ribozima HDV se autoescinda co-transcripcionalmente y esta estructura incluye además la porción -54 / -18 nt del transcrito de ARN. [25] El tramo inhibidor -24 / -15 corriente arriba de la conformación inhibidora antes mencionada está ahora secuestrado en una horquilla P (-1) ubicada corriente arriba del sitio de escisión. [25] [30] [31] El motivo P (-1), sin embargo, solo se encuentra en la secuencia genómica, lo que puede estar correlacionado con el fenómeno de que las copias genómicas de ARN del HDV son más abundantes en las células hepáticas infectadas. [25] [5] La evidencia experimental también apoya esta estructura alternativa. Primero, el mapeo estructural a través de ribonucleasa se usa para sondear el fragmento -54 / -1 en lugar de la transcripción precursora completa debido a la naturaleza de escisión rápida de esta estructura, que concuerda con la horquilla local P (-1) (entre -54 / -40 y -18 / -30 nt). [25] En segundo lugar, la conservación evolutiva se encuentra en P (-1) y la región de enlace entre P (-1) y P1 entre 21 aislados de ARN de HDV genómico. [25]
Uso en la preparación de transcripciones de ARN
Las propiedades especiales de la reacción de escisión de la ribozima HDV la convierten en una herramienta útil para preparar transcripciones de ARN con extremos 3 'homogéneos, una alternativa a la transcripción de ARN con T7 ARN polimerasa que a menudo puede producir extremos heterogéneos o adiciones no deseadas. La versión de ADNc de la ribozima puede prepararse adyacente al ADNc de la secuencia de ARN diana y el ARN preparado a partir de la transcripción con la ARN polimerasa de T7. La secuencia de ribozima se escindirá eficazmente sin requisitos posteriores, ya que el nucleótido -1 es invariante, dejando un fosfato cíclico 2′-3 ′ que puede eliminarse fácilmente mediante tratamiento con una fosfatasa o polinucleótido quinasa T4. [32] El ARN objetivo puede luego purificarse con purificación en gel.
Referencias
- ^ a b c d e f g h Ferré-D'Amaré AR, Zhou K, Doudna JA (octubre de 1998). "Estructura cristalina de una ribozima del virus de la hepatitis delta". Naturaleza . 395 (6702): 567–574. Código Bibliográfico : 1998Natur.395..567F . doi : 10.1038 / 26912 . PMID 9783582 .
- ^ a b Modahl LE, Lai MM (julio de 1998). "La transcripción del ARNm del antígeno de la hepatitis delta continúa a lo largo de la replicación del virus de la hepatitis delta (HDV): un nuevo modelo de transcripción y replicación del ARN del HDV" . Revista de Virología . 72 (7): 5449–5456. PMC 110180 . PMID 9621000 .
- ^ Macnaughton TB, Shi ST, Modahl LE, Lai MM (abril de 2002). "La replicación en círculo rodante del ARN del virus de la hepatitis delta se lleva a cabo mediante dos polimerasas de ARN celulares diferentes" . Revista de Virología . 76 (8): 3920–3927. doi : 10.1128 / JVI.76.8.3920-3927.2002 . PMC 136092 . PMID 11907231 .
- ^ Kuo MY, Sharmeen L, Dinter-Gottlieb G, Taylor J (diciembre de 1988). "Caracterización de secuencias de ARN autoescindibles en el genoma y antigenoma del virus delta de la hepatitis humana" . Revista de Virología . 62 (12): 4439–4444. PMC 253552 . PMID 3184270 .
- ^ a b Chen PJ, Kalpana G, Goldberg J, Mason W, Werner B, Gerin J, Taylor J (noviembre de 1986). "Estructura y replicación del genoma del virus de la hepatitis delta" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 83 (22): 8774–8778. doi : 10.1073 / pnas.83.22.8774 . PMC 387014 . PMID 2430299 .
- ^ a b Webb CH, Lupták A (2011). "Ribozimas autodescindibles de tipo HDV" . Biología del ARN . 8 (5): 719–727. doi : 10.4161 / rna.8.5.16226 . PMC 3256349 . PMID 21734469 .
- ^ Eickbush DG, Eickbush TH (julio de 2010). "Los retrotransposones R2 codifican una ribozima autoescindible para su procesamiento a partir de un cotranscrito de ARNr" . Biología Molecular y Celular . 30 (13): 3142–3150. doi : 10.1128 / MCB.00300-10 . PMC 2897577 . PMID 20421411 .
- ^ Webb CH, Riccitelli NJ, Ruminski DJ, Lupták A (noviembre de 2009). "Ocurrencia generalizada de ribozimas autodescindibles" . Ciencia . 326 (5955): 953. Código Bibliográfico : 2009Sci ... 326..953W . doi : 10.1126 / science.1178084 . PMC 3159031 . PMID 19965505 .
- ^ Sánchez-Luque FJ, López MC, Macias F, Alonso C, Thomas MC (octubre de 2011). "Identificación de una ribozima similar al virus de la hepatitis delta en el extremo 5 'del ARNm del retrotransposón L1Tc de Trypanosoma cruzi" . Investigación de ácidos nucleicos . 39 (18): 8065–8077. doi : 10.1093 / nar / gkr478 . PMC 3185411 . PMID 21724615 .
- ^ Sánchez-Luque F, López MC, Macias F, Alonso C, Thomas MC (enero de 2012). "Pr77 y L1TcRz: un sistema dual dentro del extremo 5 'del retrotransposón L1Tc, promotor interno y ribozima similar a HDV" . Elementos genéticos móviles . 2 (1): 1–7. doi : 10.4161 / mge.19233 . PMC 3383444 . PMID 22754746 .
- ^ Hetzel U, Szirovicza L, Smura T, Prähauser B, Vapalahti O, Kipar A, Hepojoki J (abril de 2019). "Identificación de un nuevo deltavirus en boa constrictoras" . mBio . 10 (2). doi : 10.1128 / mBio.00014-19 . PMC 6445931 . PMID 30940697 .
- ^ Chang WS, Pettersson JH, Le Lay C, Shi M, Lo N, Wille M, Eden JS, Holmes EC (julio de 2019). "Nuevos agentes similares a la hepatitis D en vertebrados e invertebrados" . Evolución del virus . 5 (2): vez021. doi : 10.1093 / ve / vez021 . PMC 6628682 . PMID 31321078 .
- ^ Paraskevopoulou S, Pirzer F, Goldmann N, Schmid J, Corman VM, Gottula LT, et al. (Julio de 2020). "Deltavirus de mamífero sin coinfección por hepadnavirus en el roedor neotropical Proechimys semispinosus " . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 117 (30): 17977–17983. doi : 10.1073 / pnas.2006750117 . PMC 7395443 . PMID 32651267 .
- ^ Perrotta AT, estado médico (enero de 1992). "Escisión de oligoribonucleótidos por una ribozima derivada de la secuencia de ARN del virus de la hepatitis delta". Bioquímica . 31 (1): 16-21. doi : 10.1021 / bi00116a004 . PMID 1731868 .
- ^ Lee TS, Radak BK, Harris ME, York DM (2016). "Una vía de conmutación conformacional mediada por dos iones metálicos para la activación de la ribozima HDV" . Catálisis ACS . 6 (3): 1853–1869. doi : 10.1021 / acscatal.5b02158 . PMC 5072530 . PMID 27774349 .
- ^ Gong B, Chen JH, Chase E, Chadalavada DM, Yajima R, Golden BL, Bevilacqua PC, Carey PR (octubre de 2007). "Medición directa de un pK (a) cercano a la neutralidad de la citosina catalítica en la ribozima genómica HDV usando cristalografía Raman". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 129 (43): 13335-13342. doi : 10.1021 / ja0743893 . PMID 17924627 .
- ^ a b Chen JH, Yajima R, Chadalavada DM, Chase E, Bevilacqua PC, Golden BL (agosto de 2010). "Una estructura cristalina 1.9 A de la preescisión de la ribozima HDV sugiere que tanto el ácido de Lewis como los mecanismos ácidos generales contribuyen a la escisión del fosfodiéster". Bioquímica . 49 (31): 6508–6518. doi : 10.1021 / bi100670p . PMID 20677830 .
- ^ a b Nakano S, Proctor DJ, Bevilacqua PC (octubre de 2001). "Caracterización mecanicista de la ribozima genómica HDV: evaluación de las contribuciones catalíticas y estructurales de iones metálicos divalentes dentro de un mecanismo de reacción multicanal". Bioquímica . 40 (40): 12022–12038. doi : 10.1021 / bi011253n . PMID 11580278 .
- ^ Rajagopal P, Feigon J (junio de 1989). "Formación de triple hebra en la homopurina: oligonucleótidos de ADN de homopirimidina d (GA) 4 yd (TC) 4". Naturaleza . 339 (6226): 637–640. doi : 10.1038 / 339637a0 . PMID 2733796 .
- ^ Sklenár V, Feigon J (junio de 1990). "Formación de un triplex estable a partir de una sola hebra de ADN". Naturaleza . 345 (6278): 836–838. Código Bibliográfico : 1990Natur.345..836S . doi : 10.1038 / 345836a0 . PMID 2359461 .
- ^ Connell GJ, Yarus M (mayo de 1994). "ARN con especificidad dual y ARN dual con especificidad similar". Ciencia . 264 (5162): 1137-1141. Bibcode : 1994Sci ... 264.1137C . doi : 10.1126 / science.7513905 . PMID 7513905 .
- ^ Legault P, Pardi A (septiembre de 1994). "Sondeo in situ de la protonación de adenina en ARN por 13C NMR". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 116 (18): 8390–8391. doi : 10.1021 / ja00097a066 .
- ^ Kasprowicz A, Kempińska A, Smólska B, Wrzesiński J, Ciesiołka J (2015). "Aplicación de una ribozima HDV antigenómica de acción trans marcada con fluorescencia para controlar las interacciones antibiótico-ARN". Métodos analíticos . 7 (24): 10414–10421. doi : 10.1039 / C5AY02953H .
- ^ Rosenstein SP, Estado en Medicina (octubre de 1991). "Evidencia de que los elementos de auto-escisión del ARN genómico y antigenómico del virus de la hepatitis delta tienen estructuras secundarias similares" . Investigación de ácidos nucleicos . 19 (19): 5409–5416. doi : 10.1093 / nar / 19.19.5409 . PMC 328906 . PMID 1923826 .
- ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q Chadalavada DM, Knudsen SM, Nakano S, Bevilacqua PC (agosto de 2000). "Un papel para la estructura del ARN aguas arriba en la facilitación del pliegue catalítico de la ribozima del virus delta de la hepatitis genómica". Revista de Biología Molecular . 301 (2): 349–367. doi : 10.1006 / jmbi.2000.3953 . PMID 10926514 .
- ^ Perrotta AT, estado médico (diciembre de 1990). "El dominio de auto-escisión del ARN genómico del virus de la hepatitis delta: requisitos de secuencia y los efectos del desnaturalizante" . Investigación de ácidos nucleicos . 18 (23): 6821–6827. doi : 10.1093 / nar / 18.23.6821 . PMC 332737 . PMID 2263447 .
- ^ Perrotta AT, estado médico (abril de 1991). "Una estructura similar a un pseudonudo requerida para la auto-escisión eficiente del ARN del virus de la hepatitis delta". Naturaleza . 350 (6317): 434–436. Código bibliográfico : 1991Natur.350..434P . doi : 10.1038 / 350434a0 . PMID 2011192 .
- ^ Matysiak M, Wrzesinski J, Ciesiołka J (agosto de 1999). "Plegamiento secuencial de la ribozima genómica del virus de la hepatitis delta: análisis estructural de intermedios de transcripción de ARN". Revista de Biología Molecular . 291 (2): 283-294. doi : 10.1006 / jmbi.1999.2955 . PMID 10438621 .
- ^ Perrotta AT, Nikiforova O, Estado en Medicina (febrero de 1999). "Una adenosina protuberante conservada en un dúplex periférico del ARN autoescindible del HDV antigenómico reduce el atrapamiento cinético de las conformaciones inactivas" . Investigación de ácidos nucleicos . 27 (3): 795–802. doi : 10.1093 / nar / 27.3.795 . PMC 148249 . PMID 9889275 .
- ^ Mathews DH, Sabina J, Zuker M, Turner DH (mayo de 1999). "La dependencia de la secuencia ampliada de los parámetros termodinámicos mejora la predicción de la estructura secundaria del ARN". Revista de Biología Molecular . 288 (5): 911–940. doi : 10.1006 / jmbi.1999.2700 . PMID 10329189 .
- ^ Zuker M, Mathews D, Turner D (1999). "Guía práctica de algoritmos y termodinámica para la predicción de estructuras secundarias de ARN". En Clark JB (ed.). Bioquímica y Biotecnología del ARN . Serie ASI de la OTAN. Dordrecht, Países Bajos: Kluwer Academic Publishers.
- ^ Wichlacz A, Legiewicz M, Ciesiołka J (febrero de 2004). "Generación de transcripciones in vitro con extremos 3 'homogéneos utilizando ribozima delta antigenómica de acción trans" . Investigación de ácidos nucleicos . 32 (3): 39e – 39. doi : 10.1093 / nar / gnh037 . PMC 373431 . PMID 14973333 .
enlaces externos
- Página de ribozima del virus de la hepatitis delta en Rfam
- Entrada de la base de datos de ARN subviral para la ribozima HDV