Calorimetría de titulación isotérmica

Calorimetría de titulación isotérmica

Acrónimo	ITC
Clasificación	Análisis térmico
Fabricantes	Instrumentos TA , Microcal / Malvern Instruments
Otras tecnicas
Relacionada	Microcalorimetría isotérmica Calorimetría diferencial de barrido

La calorimetría de titulación isotérmica ( ITC ) es una técnica física utilizada para determinar los parámetros termodinámicos de interacciones en solución. Se utiliza con mayor frecuencia para estudiar la unión de moléculas pequeñas (como compuestos medicinales) a macromoléculas más grandes ( proteínas , ADN , etc.). ^[1] Consiste en dos celdas que están encerradas en una chaqueta adiabática . Los compuestos a estudiar se colocan en la celda de muestra, mientras que la otra celda, la celda de referencia, se utiliza como control y contiene el tampón en el que se disuelve la muestra.

Medidas termodinámicas

Termograma ITC

ITC es una técnica cuantitativa que puede determinar la afinidad de unión ( ), los cambios de entalpía ( ) y la estequiometría de unión ( ) de la interacción entre dos o más moléculas en solución. A partir de estas mediciones iniciales, los cambios de energía libre de Gibbs ( ) y los cambios de entropía ( ) se pueden determinar mediante la relación:${\displaystyle K_{a}}$${\displaystyle \Delta H}$${\displaystyle n}$${\displaystyle \Delta G}$${\displaystyle \Delta S}$

${\displaystyle \Delta G=-RT\ln {K_{a}}=\Delta H-T\Delta S}$

(donde es la constante del gas y es la temperatura absoluta ).${\displaystyle R}$${\displaystyle T}$

Para obtener mediciones precisas de la afinidad de unión, la curva del termograma debe ser sigmoidea. El perfil de la curva está determinado por el valor c, que se calcula mediante la ecuación:

${\displaystyle c=n*Ka*M}$

donde es la estequiometría de la unión, es la constante de asociación y es la concentración de la molécula en la célula. ^{[ cita requerida ]}${\displaystyle n}$${\displaystyle K_{a}}$${\displaystyle M}$

El instrumento

Esquema de un instrumento ITC

Un calorímetro de titulación isotérmico está compuesto por dos celdas idénticas hechas de un material altamente eficiente térmicamente conductor y químicamente inerte, como la aleación Hastelloy o el oro, rodeadas por una camisa adiabática . ^[2] Los circuitos de termopila / termopar sensibles se utilizan para detectar diferencias de temperatura entre la celda de referencia (llena de tampón o agua) y la celda de muestra que contiene la macromolécula. Antes de la adición del ligando, se aplica una potencia constante (<1 mW) a la celda de referencia. Esto dirige un circuito de retroalimentación, activando un calentador ubicado en la celda de muestra. ^[3]Durante el experimento, el ligando se titula en la celda de muestra en alícuotas conocidas con precisión, lo que hace que se absorba o se desarrolle calor (dependiendo de la naturaleza de la reacción). Las mediciones consisten en la entrada de energía dependiente del tiempo requerida para mantener temperaturas iguales entre la muestra y las celdas de referencia. ^{[ cita requerida ]}

En una reacción exotérmica , la temperatura en la celda de muestra aumenta con la adición de ligando . Esto hace que la potencia de retroalimentación a la celda de muestra disminuya (recuerde: se aplica una potencia de referencia a la celda de referencia) para mantener una temperatura igual entre las dos celdas. En una reacción endotérmica ocurre lo contrario; el circuito de retroalimentación aumenta la potencia para mantener una temperatura constante (funcionamiento isotérmico / isotérmico). ^{[ cita requerida ]}

Las observaciones se representan como la potencia necesaria para mantener la referencia y la celda de muestra a una temperatura idéntica en función del tiempo. Como resultado, los datos brutos experimentales consisten en una serie de picos de flujo de calor (potencia), y cada pico corresponde a una inyección de ligando. Estos picos / pulsos de flujo de calor se integran con respecto al tiempo, dando el calor total intercambiado por inyección. El patrón de estos efectos de calor en función de la relación molar [ligando] / [macromolécula] se puede analizar para obtener los parámetros termodinámicos de la interacción en estudio. La desgasificación de las muestras suele ser necesaria para obtener buenas mediciones, ya que la presencia de burbujas de gas dentro de la celda de muestra dará lugar a gráficos de datos anormales en los resultados registrados. Todo el experimento se lleva a cabo bajo el control de una computadora. ^{[cita requerida ]}

Aplicación en el descubrimiento de fármacos

ITC es una de las últimas técnicas que se utilizará para caracterizar la afinidad de unión de los ligandos a las proteínas. Por lo general, se utiliza como técnica de cribado secundaria en el cribado de alto rendimiento. ITC es particularmente útil ya que proporciona no solo la afinidad de unión, sino también la termodinámica de la unión. Esta caracterización termodinámica permite una mayor optimización de los compuestos. ^[4]

Ver también

• Calorimetría diferencial de barrido
• Interferometría de polarización dual
• Calorimetría de perturbación de presión
• Resonancia de plasmones superficiales

Referencias

1. Pierce, Michael M .; Raman, CS; Nall, Barry T. (1999). "Calorimetría de titulación isotérmica de interacciones proteína-proteína". Métodos . 19 (2): 213-221. CiteSeerX  10.1.1.385.1426 . doi : 10.1006 / meth.1999.0852 . PMID  10527727 .
2. O'Brien, R., Ladbury, JE y Chowdry BZ (2000) Calorimetría de titulación isotérmica de biomoléculas. Capítulo 10 en Interacciones proteína-ligando: hidrodinámica y calorimetría Ed. Harding, SE y Chowdry, BZ, Oxford University Press. ISBN 0-19-963746-6 
3. Manual de instrucciones de VP-ITC (2001). Microcal Inc., Northampton, MA. http://www.microcalorimetry.com
4. Desphande, T. Calorimetría de titulación isotérmica (ITC): Aplicación en el descubrimiento de fármacos