KcsA ( K c hannel de s treptomyces A ) es un canal de potasio procariota de la bacteria del suelo Streptomyces lividans que se ha estudiado ampliamente en la investigación de canales iónicos . La proteína activada por pH [1] posee dos segmentos transmembrana y una región de poros altamente selectiva, responsable de la entrada y salida de los iones K + fuera de la célula. [2] La secuencia de aminoácidos que se encuentra en el filtro de selectividad de KcsA está altamente conservada entre los canales de voltaje de K + procarióticos y eucarióticos ; [1] [3]como resultado, la investigación sobre KcsA ha proporcionado una importante comprensión estructural y mecanicista sobre la base molecular para la selección y conducción de iones K + . Como uno de los canales iónicos más estudiados hasta el día de hoy, KcsA es una plantilla para la investigación sobre la función del canal de K + y su estructura aclarada subyace en el modelado computacional de la dinámica del canal para especies procariotas y eucariotas. [4]
Canal de potasio KcsA | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | KcsA | |||||||
Pfam | PF07885 | |||||||
InterPro | IPR013099 | |||||||
SCOP2 | 1bl8 / SCOPe / SUPFAM | |||||||
Superfamilia OPM | 8 | |||||||
Proteína OPM | 1r3j | |||||||
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Historia
KcsA fue el primer canal de iones de potasio que se caracterizó mediante cristalografía de rayos X por Roderick MacKinnon y sus colegas en 1998. En los años previos a esto, la investigación sobre la estructura de los canales de K + se centró en el uso de pequeñas toxinas que se unen a revelan la ubicación del filtro de poros y selectividad entre los residuos del canal. Grupo de MacKinnon teorizó la tetramérica disposición de los transmembrana segmentos, e incluso sugirió presencia de formadores de poros “bucles” en la región de filtro hechos de segmentos cortos de aminoácidos que interactúan con K + iones que pasa a través del canal [5] El descubrimiento de fuerte La homología de secuencia entre KcsA y otros canales de la familia Kv, incluida la proteína Shaker , atrajo la atención de la comunidad científica, especialmente cuando la secuencia de firma del canal K + comenzó a aparecer en otros genes procarióticos . La simplicidad de las dos hélices transmembrana en KcsA, a diferencia de las seis en muchos canales iónicos eucariotas , también proporcionó un método para comprender los mecanismos de conducción de los canales de K + a un nivel más rudimentario, proporcionando así un gran impulso para el estudio de KcsA. .
La estructura cristalina de KcsA fue resuelta por el grupo MacKinnon en 1998 después del descubrimiento de que la eliminación del dominio citoplasmático del extremo C de la proteína nativa (residuos 126-158) aumenta la estabilidad de las muestras cristalizadas. Se produjo un modelo de KcsA con una resolución de 3.2A que confirmó la disposición tetramérica de la proteína alrededor de un poro central, con una hélice de cada subunidad orientada hacia el eje interior y la otra hacia el exterior. [6] Tres años más tarde, Morais-Cabral y Zhou produjeron un modelo de mayor resolución después de que los fragmentos monoclonales Fab se unieran a los cristales de KcsA para estabilizar aún más el canal. [7] A principios de la década de 2000, surgieron pruebas de la ocupación del filtro de selectividad por dos átomos de K + durante el proceso de transporte, basándose en cálculos energéticos y electrostáticos realizados para modelar la región de los poros. Desde entonces, la investigación continua de las diversas conformaciones abiertas y cerradas, inactivas y activas de KcsA por otros métodos de imagen como ssNMR y EPR ha proporcionado aún más información sobre la estructura del canal y las fuerzas que activan el cambio de la inactivación del canal a la conducción.
En 2007, Riek et. Alabama. mostró que la apertura del canal que resulta de la titulación del canal iónico de pH 7 a pH 4, corresponde a cambios conformacionales en dos regiones: la transición al estado de intercambio iónico del filtro de selectividad y la apertura de la disposición de TM2 en el C -terminus . [8] Este modelo explica la capacidad de KcsA para seleccionar simultáneamente iones K + al mismo tiempo que controla la conductancia eléctrica. En 2011, la estructura cristalina de KcsA de longitud completa se resolvió para revelar que el impedimento de los residuos previamente truncados solo permite la expansión directa de la región de paso de iones intercelulares de la proteína. Esta investigación proporciona una visión más detallada del movimiento de regiones de canales separados durante la conducción de iones. [9] En la actualidad, los estudios de KcsA se centran en el uso del canal procariota como modelo para la dinámica del canal de los canales de K + eucariotas más grandes , incluido el hERG .
Estructura
La estructura de KcsA es la de un cono invertido , con un poro central que recorre el centro formado por dos hélices transmembrana (la hélice externa M1 y la hélice interna M2), que atraviesan la bicapa lipídica . El canal en sí es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades de dominio único idénticas (cada una con dos hélices α) dispuestas de modo que una hélice M2 se enfrenta al poro central, mientras que la otra hélice M1 se enfrenta a la membrana lipídica . Las hélices internas están inclinadas aproximadamente 25 ° en relación con la membrana lipídica y están ligeramente dobladas, abriéndose para mirar hacia el exterior de la célula como una flor. [6] Estas dos hélices TM están unidas por un bucle reentrante, disperso simétricamente alrededor de un eje común correspondiente al poro central . La región de los poros abarca aproximadamente 30 residuos de aminoácidos y se puede dividir en tres partes: un filtro de selectividad cerca del lado extracelular, una cavidad llena de agua dilatada en el centro y una puerta cerrada cerca del lado citoplasmático formado por cuatro hélices M2 empaquetadas. [6] Esta arquitectura se encuentra altamente conservada en la familia de los canales de potasio [10] [11] tanto en eucariotas como en procariotas.
La longitud total del poro es de 45 Å y su diámetro varía considerablemente dentro de las distintas regiones del túnel interior. Viajando desde la región intracelular hacia afuera (de abajo hacia arriba en la imagen), el poro comienza con una región de puerta formada por hélices M2 de 18 Å de diámetro, y luego se abre en una cavidad ancha (∼10 Å de ancho) cerca del centro de la membrana. . [6] En estas regiones, los iones de K + están en contacto con las moléculas de agua circundantes, pero cuando ingresan al canal desde el filtro de selectividad en la parte superior, la cavidad es tan estrecha que los iones de K + deben eliminar cualquier agua hidratante para ingresar al célula. [6] Con respecto a la composición de aminoácidos de los residuos que recubren los poros dentro de KcsA, las cadenas laterales que recubren el poro interno y la cavidad son predominantemente hidrófobas , pero dentro del filtro de selectividad están presentes aminoácidos polares que entran en contacto con los iones K + deshidratados .
Filtro de selectividad
El extremo más ancho del cono corresponde a la boca extracelular del canal formado por hélices porosas, más un filtro de selectividad que está formado por una secuencia TVGYG , (Treonina, Valina, Glicina, Tirosina, Glicina), característica de los canales de potasio. [12] Dentro de esta región, la coordinación entre los aminoácidos TVGYG y los iones K + entrantes permite la conducción de iones a través del canal. El filtro de selectividad de KcsA contiene cuatro sitios de unión de iones, aunque se propone que solo dos de estas cuatro posiciones estén ocupadas al mismo tiempo. El filtro de selectividad tiene un diámetro de aproximadamente 3 Å. [13] aunque las simulaciones de dinámica molecular sugieren que el filtro es flexible. [14] La presencia de TVGYG en la región de filtro de KcsA se conserva incluso en canales eucariotas más complejos, lo que convierte a KcsA en un sistema óptimo para estudiar la conductancia del canal de K + entre especies.
Función
El canal KcsA se considera un canal modelo porque la estructura KcsA proporciona un marco para comprender la conducción del canal K + , que tiene tres partes: selectividad de potasio , activación del canal por sensibilidad al pH e inactivación del canal dependiente de voltaje. La permeación del ión K + se produce en la región superior del filtro de selectividad del poro, mientras que la compuerta del pH aumenta a partir de la protonación de las hélices transmembrana al final del poro. A pH bajo, la hélice M2 se protona, cambiando el canal iónico de una conformación cerrada a una abierta. [15] A medida que los iones fluyen a través del canal, se cree que los mecanismos de activación de voltaje inducen interacciones entre Glu71 y Asp80 en el filtro de selectividad, que desestabilizan la conformación conductora y facilitan la entrada en un estado no conductor de larga duración que se asemeja al tipo C inactivación. de canales dependientes de voltaje . [dieciséis]
En la conformación no conductora de KcsA a pH 7, K + se une estrechamente a los oxígenos coordinadores del filtro de selectividad y las cuatro hélices TM2 convergen cerca de la unión citoplásmica para bloquear el paso de los iones de potasio. [8] Sin embargo, a pH 4, KcsA sufre intercambios conformacionales en una escala de tiempo de milisegundos que filtran los estados permeables y no permeables y entre las conformaciones abiertas y cerradas de las hélices M2. [8] Si bien estos cambios conformacionales distintos ocurren en regiones separadas del canal, el comportamiento molecular de cada región está vinculado tanto por interacciones electrostáticas como por alosterio . [8] La dinámica de este intercambio de configuraciones estereoquímicas en el filtro proporciona la base física para la conductancia y la compuerta de K + simultáneas .
Selectividad K +
La secuencia TVGYG es especialmente importante para mantener la especificidad de potasio de KcsA. Las glicinas en esta secuencia de filtro de selectividad tienen ángulos diedros que permiten que los átomos de oxígeno del carbonilo en la estructura de la proteína del filtro apunten en una dirección, hacia los iones a lo largo del poro. [5] Las glicinas y la treonina se coordinan con el ión K + , mientras que las cadenas laterales de valina y tirosina se dirigen al núcleo de la proteína para imponer una restricción geométrica al filtro. Como resultado, el tetrámero de KcsA alberga cuatro sitios de unión de K + espaciados iguales , con cada lado compuesto por una jaula formada por ocho átomos de oxígeno que se asientan en los vértices de un cubo. Los átomos de oxígeno que rodean a los iones de K + en el filtro están dispuestos como las moléculas de agua que rodean a los iones de K + hidratados en la cavidad del canal; esto sugiere que la coordinación del oxígeno y los sitios de unión en el filtro de selectividad están pagando el costo energético de la deshidratación del K + . [5] Debido a que el ion Na + es demasiado pequeño para estos sitios de unión del tamaño de K + , la energía de deshidratación no se compensa y, por lo tanto, el filtro selecciona contra otros iones extraños. [5] Además, el canal KcsA está bloqueado por iones Cs + y la activación requiere la presencia de iones Mg 2+ . [1]
Sensibilidad al pH
La conductancia dependiente del pH de KcsA indica que la apertura del canal iónico ocurre cuando la proteína se expone a un ambiente más ácido. Los estudios de RMN realizados por el grupo Riek muestran que la sensibilidad al pH se produce tanto en la región C-terminal TM2 de la proteína como con los residuos Tyr78 y Gly79 en el filtro de selectividad. Existe evidencia que sugiere que el sensor de pH principal está en el dominio citoplasmático. El intercambio de aminoácidos cargados negativamente por neutros hizo que el canal KcsA fuera insensible al pH, aunque no hubo cambios de aminoácidos en la región transmembrana. [17] [18] Además, entre el pH de 6 y 7, la histidina es una de las pocas cadenas laterales titulables de histidinas; están ausentes en los segmentos transmembrana y extracelular de TM2, pero están presentes en el extremo C-terminal de KcsA. Esto destaca un posible mecanismo para la apertura lenta de KcsA que es particularmente sensible al pH, especialmente porque la propagación conformacional de la señal de apertura del canal desde el extremo C-terminal al filtro de selectividad podría ser importante para coordinar los cambios estructurales necesarios para la conductancia a lo largo de todo el poro. .
Los estudios de RMN también sugieren que existe una red compleja de enlaces de hidrógeno entre Tyr78, Gly79, Glu71 y Asp80 en la región del filtro KcsA, y además actúa como un disparador sensible al pH para la conductancia. La mutación de residuos clave en la región, incluido E71A, da como resultado un gran costo de energía de 4 kcal mol -1 , equivalente a la pérdida del enlace de hidrógeno entre Glu71 y Tyr78 y el enlace de hidrógeno mediado por agua entre Glu71 y Asp80 en KcsA (E71A). Estos estudios destacan aún más el papel de la compuerta de pH en la función del canal KcsA.
Puerta de voltaje
En 2006, el grupo Perozo propuso una explicación mecanicista de los efectos de los campos de voltaje en la compuerta de KcsA. Después de añadir una corriente despolarizante al canal, se produce la reorientación de Glu71 hacia el poro intracelular, interrumpiendo así el par carboxilo-carboxilato Glu71-Asp80 que inicialmente estabiliza el filtro de selectividad. El colapso de la región del filtro evita la entrada o facilita la salida del estado inactivo. [16] Glu71, una parte clave de la secuencia de firma del filtro de selectividad que se conserva entre los canales de iones de K + , juega un papel fundamental en la compuerta, ya que su capacidad para reorientarse en la dirección del campo de voltaje transmembrana puede proporcionar una explicación para eventos de activación de voltaje en KcsA. La orientación de los aminoácidos en la región del filtro podría desempeñar un papel fisiológico significativo en la modulación de los flujos de potasio en eucariotas y procariotas en condiciones de estado estacionario. [dieciséis]
Investigar
Función
El mecanismo preciso de la selectividad del canal de potasio continúa siendo estudiado y debatido y se utilizan múltiples modelos para describir diferentes aspectos de la selectividad. Se han aplicado a KcsA modelos que explican la selectividad basados en el concepto de intensidad de campo desarrollado por George Eisenman [19] basado en la ley de Coulomb . [14] [20] Una explicación alternativa para la selectividad de KcsA se basa en el modelo de ajuste perfecto (también conocido como modelo de ajuste perfecto) desarrollado por Francisco Bezanilla y Armstrong . [21] Los átomos de oxígeno del carbonilo de la cadena principal que componen el filtro de selectividad se mantienen en una posición precisa que les permite sustituir las moléculas de agua en la capa hidratada del ión potasio , pero están demasiado lejos del ión sodio . Otros trabajos han estudiado las diferencias termodinámicas en la unión de iones, [22] consideraciones topológicas, [23] [24] y el número de sitios de unión continua de iones. [25]
Además, una limitación importante del estudio y las simulaciones de la estructura cristalina aún no se ha discutido: la estructura cristalina mejor resuelta y más aplicada de KcsA parece ser la de la forma "cerrada" del canal. Esto es razonable ya que el estado cerrado del canal se favorece a pH neutro , en el que la estructura cristalina se resolvió por cristalografía de rayos X . Sin embargo, el comportamiento dinámico de KcsA dificulta el análisis del canal ya que una estructura cristalina proporciona inevitablemente una imagen estática, promediada espacial y temporalmente de un canal. Para cerrar la brecha entre la estructura molecular y el comportamiento fisiológico, se requiere una comprensión de la dinámica de resolución atómica de los canales de potasio.
Aplicaciones
Debido a la alta similitud de secuencia entre el poro de KcsA y otras proteínas eucariotas del canal de iones de K + , KcsA ha proporcionado información importante sobre el comportamiento de otras proteínas conductoras de voltaje importantes, como el Shaker derivado de la drosophilla y el canal de potasio hERG humano . KcsA se ha utilizado en estudios de mutagénesis para modelar las interacciones entre hERG y varios compuestos farmacológicos. Estas pruebas pueden detectar interacciones entre el fármaco y el canal hERG que causan el síndrome de QT largo adquirido , y son esenciales para determinar la seguridad cardíaca de los nuevos medicamentos. [26] Además, los modelos de homología basados en la estructura cristalina de KcsA de estado cerrado se han generado computacionalmente para construir una representación de estados múltiples del canal de K + cardíaco hERG . Dichos modelos revelan la flexibilidad del canal hERG y pueden predecir consistentemente la afinidad de unión de un conjunto de diversos ligandos que interactúan con los canales iónicos. El análisis de las estructuras complejas de ligando-hERG se puede utilizar para guiar la síntesis de análogos de fármacos con riesgo reducido de hERG, basándose en la estructura del fármaco y el potencial de acoplamiento. [27]
Ver también
- Canal de calcio
- Canal de potasio
- Canal de sodio
Referencias
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