Microdisección por captura láser
La microdisección por captura láser ( LCM ), también llamada microdisección , microdisección láser ( LMD ) o microdisección asistida por láser ( LMD o LAM ), es un método para aislar células de interés específicas de regiones microscópicas de tejido /células/ organismos [1] [ 2] ( disección a escala microscópica con la ayuda de un láser ).
La microdisección por captura láser (LCM) es un método para adquirir subpoblaciones de células de tejido bajo visualización microscópica directa. La tecnología LCM puede recolectar las células de interés directamente o puede aislar células específicas cortando las células no deseadas para obtener poblaciones de células enriquecidas histológicamente puras. Existe una variedad de aplicaciones posteriores: genotipado de ADN y análisis de pérdida de heterocigosidad (LOH), perfilado de transcritos de ARN , generación de bibliotecas de cDNA , descubrimiento de proteómica y perfilado de rutas de señales. El tiempo total necesario para llevar a cabo este protocolo suele ser de 1 a 1,5 h. [3]
Se acopla un láser a un microscopio y se enfoca en el tejido del portaobjetos. Mediante el movimiento del láser por la óptica o la platina, el foco sigue una trayectoria predefinida por el usuario. Esta trayectoria, también llamada elemento , se recorta y se separa del tejido adyacente. Después del proceso de corte, debe seguir un proceso de extracción si se desea un proceso de extracción. Las tecnologías más recientes utilizan microdisección sin contacto.
Hay varias formas de extraer tejido de un portaobjetos de microscopio con una muestra de histopatología . Presione una superficie adhesiva sobre la muestra y sáquela. Esto extrae la región deseada, pero también puede eliminar partículas o tejido no deseado de la superficie, porque la superficie no es selectiva. Derretir una membrana de plástico sobre la muestra y arrancar. El calor se introduce, por ejemplo, mediante un láser rojo o infrarrojo (IR) sobre una membrana teñida con un colorante absorbente. Como esto adhiere la muestra deseada a la membrana, como con cualquier membrana que se coloca cerca de la superficie de la muestra de histopatología, es posible que se extraigan algunos residuos. Otro peligro es el calor introducido: algunas moléculas como el ADN, el ARN o las proteínas no permiten calentarse demasiado o en absoluto con el fin de aislarlas de la forma más pura posible.
Para transporte sin contacto. Hay tres enfoques diferentes. Transporte por gravedad usando un microscopio vertical (llamado GAM, microdisección asistida por gravedad ) o transporte por catapulta de presión láser ; la generación más reciente utiliza una tecnología basada en la transferencia directa inducida por láser(ELEVAR). Con corte y captura, se coloca una tapa recubierta con un adhesivo directamente sobre la sección de tejido finamente cortada (5-8 μm), la propia sección descansa sobre una membrana delgada (polietileno naftaleno). Un láser IR calienta suavemente el adhesivo de la tapa fusionándolo con el tejido subyacente y un láser UV corta el tejido y la membrana subyacente. La entidad de tejido de membrana ahora se adhiere a la tapa y las células de la tapa se pueden usar en aplicaciones posteriores (ADN, ARN, análisis de proteínas). [4]
Bajo un microscopio usando una interfaz de software, se observa una sección de tejido (típicamente de 5 a 50 micrómetros de espesor) y se identifican células individuales o grupos de células, ya sea manualmente o de forma semiautomática o más automatizada, lo que permite la obtención de imágenes y luego la selección automática de objetivos para el aislamiento. Actualmente existen seis tecnologías primarias de aislamiento/recolección que utilizan un microscopio y un dispositivo para el aislamiento celular. Cuatro de ellos suelen utilizar un láser ultravioleta pulsado (355 nm) para cortar los tejidos directamente o las membranas/películas y, a veces, en combinación con un láser IR .láser responsable de calentar/fundir un polímero pegajoso para la adhesión y el aislamiento celular. El láser IR proporciona un enfoque más suave para la microdisección. Una quinta tecnología basada en láser ultravioleta utiliza portaobjetos especiales recubiertos con un recubrimiento de transferencia de energía que, cuando se activa con el pulso láser, impulsa el tejido o las células hacia una tapa de recolección.
