Una biblioteca de ADNc es una combinación de fragmentos de ADNc ( ADN complementario ) clonados insertados en una colección de células huésped, que constituyen una parte del transcriptoma del organismo y se almacenan como una " biblioteca ". El ADNc se produce a partir del ARNm completamente transcrito que se encuentra en el núcleo y, por lo tanto, contiene solo los genes expresados de un organismo. De manera similar, se pueden producir bibliotecas de ADNc específicas de tejido. En las células eucariotas , el ARNm maduro ya está empalmado , por lo que el ADNc producido carece de intrones.y se puede expresar fácilmente en una célula bacteriana. Si bien la información en las bibliotecas de ADNc es una herramienta poderosa y útil, ya que los productos génicos se identifican fácilmente, las bibliotecas carecen de información sobre potenciadores , intrones y otros elementos reguladores que se encuentran en una biblioteca de ADN genómico .
Construcción de la biblioteca de ADNc
El ADNc se crea a partir de un ARNm maduro de una célula eucariota con el uso de transcriptasa inversa . En eucariotas, una cola de poli (A) (que consta de una secuencia larga de nucleótidos de adenina) distingue el ARNm del ARNt y el ARNr y, por lo tanto, puede usarse como un sitio de cebador para la transcripción inversa. Esto tiene el problema de que no todas las transcripciones, como las de la histona , codifican una cola poli-A .
extracción de ARNm
En primer lugar, el ARNm se obtiene y se purifica del resto de ARN. Existen varios métodos para purificar el ARN, como la extracción con trizol y la purificación en columna . La purificación de la columna se realiza utilizando resinas oligoméricas recubiertas de nucleótidos dT en las que solo se unirá el ARNm que tiene la cola poli-A. El resto de los ARN se eluyen. El ARNm se eluye usando tampón de elución y algo de calor para separar las cadenas de ARNm de oligo-dT.
construcción de ADNc
Una vez que se purifica el ARNm, el oligo-dT (una secuencia corta de nucleótidos de desoxi-timidina) se etiqueta como un cebador complementario que se une a la cola poli-A proporcionando un extremo 3'-OH libre que puede extenderse mediante transcriptasa inversa para crear la hebra de ADN complementaria. Ahora, el ARNm se elimina mediante el uso de una enzima ARNasa que deja un ADNc monocatenario (ADNcc). Este sscDNA se convierte en un ADN de doble hebra con la ayuda de la ADN polimerasa . Sin embargo, para que la ADN polimerasa sintetice una hebra complementaria se necesita un extremo 3'-OH libre. Esto lo proporciona el propio sscDNA generando un bucle de horquilla en el extremo 3 'enrollando sobre sí mismo. La polimerasa extiende el extremo 3'-OH y luego el bucle en el extremo 3 'se abre mediante la acción de tijera de la nucleasa S 1 . A continuación, se utilizan endonucleasas de restricción y ADN ligasa para clonar las secuencias en plásmidos bacterianos .
A continuación, se seleccionan las bacterias clonadas, comúnmente mediante el uso de selección de antibióticos. Una vez seleccionadas, se crean reservas de bacterias que luego se pueden cultivar y secuenciar para compilar la biblioteca de ADNc.
Usos de la biblioteca de ADNc
Las bibliotecas de ADNc se usan comúnmente cuando se reproducen genomas eucariotas, ya que la cantidad de información se reduce para eliminar la gran cantidad de regiones no codificantes de la biblioteca. Las bibliotecas de ADNc se utilizan para expresar genes eucariotas en procariotas. Los procariotas no tienen intrones en su ADN y, por lo tanto, no poseen ninguna enzima que pueda eliminarlo durante el proceso de transcripción. El ADNc no tiene intrones y, por lo tanto, puede expresarse en células procariotas. Las bibliotecas de ADNc son más útiles en genética inversa donde la información genómica adicional es de menor utilidad. Además, las bibliotecas de ADNc se utilizan con frecuencia en la clonación funcional para identificar genes basándose en la función de la proteína codificada. Al estudiar el ADN eucariota, las bibliotecas de expresión se construyen utilizando ADN complementario (ADNc) para ayudar a garantizar que el inserto sea realmente un gen. [1]
Biblioteca de ADNc frente a biblioteca de ADN genómico
La biblioteca de ADNc carece de los elementos reguladores y no codificantes que se encuentran en el ADN genómico. Las bibliotecas de ADN genómico proporcionan información más detallada sobre el organismo, pero su generación y mantenimiento requieren más recursos.
Clonación de ADNc
Las moléculas de ADNc se pueden clonar utilizando enlazadores de sitios de restricción. Los enlazadores son piezas cortas de ADN de doble hebra ( oligodesoxirribonucleótido ) de aproximadamente 8 a 12 pares de nucleótidos de longitud que incluyen un sitio de escisión de endonucleasas de restricción , por ejemplo, BamHI. Tanto el ADNc como el enlazador tienen extremos romos que pueden ligarse entre sí usando una alta concentración de ADN ligasa de T4. Luego, los extremos pegajosos se producen en la molécula de ADNc escindiendo los extremos del ADNc (que ahora tienen conectores con un sitio incorporado) con la endonucleasa apropiada. A continuación, también se escinde un vector de clonación ( plásmido ) con la endonucleasa apropiada. Después de la ligación del " extremo adhesivo " del inserto en el vector, la molécula de ADN recombinante resultante se transfiere a la célula huésped de E. coli para su clonación.