La microscopía de fluorescencia de lámina de luz ( LSFM ) es una técnica de microscopía de fluorescencia con una resolución óptica de intermedia a alta [1] , pero con buenas capacidades de corte óptico y alta velocidad. A diferencia de la microscopía de epifluorescencia, solo una fina rebanada (normalmente de unos cientos de nanómetros a unos pocos micrómetros) de la muestra se ilumina perpendicularmente a la dirección de observación. Para la iluminación, un láserSe utiliza una lámina de luz, es decir, un rayo láser que se enfoca sólo en una dirección (por ejemplo, utilizando una lente cilíndrica). Un segundo método utiliza un haz circular escaneado en una dirección para crear la hoja de luz. Como solo se ilumina la sección realmente observada, este método reduce el fotodaño y el estrés inducidos en una muestra viva. Además, la buena capacidad de corte óptico reduce la señal de fondo y, por lo tanto, crea imágenes con mayor contraste, comparable a la microscopía confocal . Debido a que LSFM escanea muestras usando un plano de luz en lugar de un punto (como en la microscopía confocal), puede adquirir imágenes a velocidades de 100 a 1,000 veces más rápidas que las que ofrecen los métodos de escaneo puntual.
Este método se utiliza en biología celular [2] y para microscopía de órganos, embriones y organismos intactos, a menudo eliminados químicamente. [3]
A partir de 1994, LSFM se desarrolló como microscopía o tomografía de sección óptica de fluorescencia de plano ortogonal (OPFOS) [4] principalmente para muestras grandes y más tarde como microscopía de iluminación selectiva / de plano único (SPIM) también con resolución subcelular. [5] Esto introdujo un esquema de iluminación en microscopía de fluorescencia, que ya se ha utilizado con éxito para microscopía de campo oscuro bajo el nombre de ultramicroscopía . [6]
Configuración de LSFM
Configuración básica
En este tipo de microscopía, [7] la iluminación se realiza perpendicularmente a la dirección de observación (ver imagen esquemática en la parte superior del artículo). El rayo expandido de un láser se enfoca en una sola dirección mediante una lente cilíndrica, o mediante una combinación de una lente cilíndrica y un objetivo de microscopio, ya que este último está disponible en mejor calidad óptica y con mayor apertura numérica que el primero. De esta manera, se crea una fina hoja de luz o una hoja de luz en la región focal que se puede usar para excitar la fluorescencia solo en una porción delgada (generalmente de unos pocos micrómetros de espesor) de la muestra.
La luz de fluorescencia emitida por la lámina de luz se recoge perpendicularmente con un objetivo de microscopio estándar y se proyecta en un sensor de imágenes (normalmente un CCD , una cámara CCD de multiplicación de electrones o CMOS ). Para dejar suficiente espacio para la óptica de excitación / lámina de luz, se utiliza un objetivo de observación con una gran distancia de trabajo. En la mayoría de los LSFM, el objetivo de detección y, a veces, también el objetivo de excitación, están completamente sumergidos en el búfer de muestra, por lo que generalmente la muestra y la óptica de excitación / detección están incrustadas en una cámara de muestra llena de búfer, que también se puede usar para controlar las condiciones ambientales ( temperatura, nivel de dióxido de carbono ...) durante la medición. El montaje de muestra en LSFM se describe a continuación con más detalle.
Como tanto la hoja de luz de excitación como el plano focal de la óptica de detección tienen que coincidir para formar una imagen, no se puede enfocar diferentes partes de la muestra al trasladar el objetivo de detección, sino que generalmente se traslada y gira toda la muestra.
Extensiones de la idea básica de LSFM
En los últimos años, se han desarrollado varias extensiones de este esquema:
- El uso de dos hojas de luz de contrapropagación ayuda a reducir los artefactos típicos de SPIM, como el sombreado (consulte la primera pila z arriba) [8]
- Además de las hojas de luz de contrapropagación, se propuso una configuración con detección desde dos lados opuestos en 2012. [9] [10] Esto permite la medición de pilas zy de rotación para una reconstrucción 3D completa de la muestra más rápidamente.
- La hoja de luz también se puede crear escaneando un enfoque láser normal hacia arriba y hacia abajo. [11] Esto también permite el uso de haces auto-reconstruibles (como haces bessel o haces Airy ) para la iluminación que mejoran la penetración de la lámina de luz en muestras gruesas, ya que se reduce el efecto negativo de la dispersión en la lámina de luz. [12] [13] [14] Estos haces auto-reconstruibles pueden modificarse para contrarrestar las pérdidas de intensidad usando técnicas de compensación de atenuación, aumentando aún más la señal recolectada dentro de muestras gruesas. [15]
- En microscopía de plano oblicuo (OPM) [16], el objetivo de detección se utiliza para crear también la hoja de luz: la hoja de luz ahora se emite desde este objetivo en un ángulo de aproximadamente 60 °. Se utilizan ópticas adicionales para inclinar también el plano focal utilizado para la detección en el mismo ángulo.
- LSFM también se ha combinado con excitación de dos fotones (2P) , lo que mejora la penetración en muestras gruesas y dispersas. [17] El uso de excitación 2P en longitudes de onda del infrarrojo cercano se ha utilizado para reemplazar la excitación 1P en longitudes de onda azul-visible en experimentos de imágenes cerebrales que involucran la respuesta a estímulos visuales. [18]
- SPIM también se puede combinar con técnicas como la espectroscopia de correlación de fluorescencia , para permitir mediciones de movilidad resueltas espacialmente de partículas fluorescentes (por ejemplo, perlas fluorescentes, puntos cuánticos o proteínas marcadas con fluorescencia) dentro de muestras biológicas vivas. [19] [20]
- También se ha informado de una combinación de un microscopio SPIM con una cámara intensificadora de imagen con compuerta que permitió medir un mapa de la vida útil de la fluorescencia ( imágenes de vida útil de la fluorescencia , FLIM). [21]
- LSFM se combinó con técnicas de microscopía de súper resolución para mejorar su resolución más allá del límite de Abbe. [22] [23] También se ha publicado una combinación de microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) y SPIM, que conduce a un grosor reducido de la lámina de luz debido al efecto STED. [24] Véase también la sección sobre el poder de resolución de LSFM a continuación.
- El LSFM se modificó para ser compatible con todos los objetivos, incluso los objetivos de inmersión en aceite basados en cubreobjetos con alta apertura numérica para aumentar la resolución espacial nativa y la eficiencia de detección de fluorescencia. [25] Esta técnica implica inclinar la hoja de luz en relación con el objetivo de detección en un ángulo preciso para permitir que la hoja de luz se forme en la superficie de los cubreobjetos de vidrio.
- LSFM se combinó con técnicas de Óptica Adaptativa en 2012 para mejorar la profundidad de las imágenes en muestras gruesas y no homogéneas a una profundidad de 350 um. [26] Se colocó un sensor de frente de onda Shack Hartmann en la ruta de detección y las estrellas guía se utilizan en un circuito de retroalimentación cercano. En su tesis, [27] el autor discute la ventaja de contar con Óptica Adaptativa tanto en la ruta de iluminación como de detección del LSFM para corregir las aberraciones inducidas por la muestra.
Montaje de muestra
La separación de las trayectorias del haz de iluminación y detección en LSFM (excepto en microscopía de plano oblicuo ) crea la necesidad de métodos especializados de montaje de muestras. Hasta la fecha, la mayoría de los LSFM están construidos de tal manera que la iluminación y la trayectoria del haz de detección se encuentran en un plano horizontal (consulte las ilustraciones de arriba), por lo que la muestra generalmente cuelga desde la parte superior hacia la cámara de muestras o descansa sobre un soporte vertical dentro de la muestra. cámara. Se han desarrollado varios métodos para montar todo tipo de muestras:
- Las muestras fijas (y potencialmente también despejadas) se pueden pegar a un soporte o soporte simple y pueden permanecer en su solución de fijación durante la toma de imágenes.
- Los organismos vivos más grandes generalmente se sedan y se montan en un cilindro de gel suave que se extrae de un capilar (de vidrio o plástico) que cuelga desde arriba hacia la cámara de muestra.
- Las células adherentes se pueden cultivar en pequeñas placas de vidrio que cuelgan en la cámara de muestras.
- Las plantas se pueden cultivar en geles transparentes que contienen un medio de crecimiento. Los geles se cortan en la posición de la imagen, por lo que no reducen la lámina de luz y la calidad de la imagen por dispersión y absorción. [28]
- Las muestras líquidas (por ejemplo, para espectroscopía de correlación de fluorescencia ) se pueden montar en pequeñas bolsas hechas de una fina lámina de plástico que coincida con el índice de refracción del medio de inmersión circundante en la cámara de muestra. [20]
Se han desarrollado algunos LSFM en los que la muestra se monta como en microscopía estándar (por ejemplo, las células crecen horizontalmente en el fondo de una placa de Petri ) y las ópticas de excitación y detección se construyen en un plano vertical desde arriba. Esto también permite combinar un LSFM con un microscopio invertido estándar y evita la necesidad de procedimientos especializados de montaje de muestras. [19] [29] [30] [31]
Propiedades de la imagen LSFM
Modos de imagen típicos
La mayoría de los LSFM se utilizan para producir imágenes en 3D de la muestra moviendo la muestra a través del plano de la imagen. Si la muestra es más grande que el campo de visión del sensor de imagen, la muestra también debe desplazarse lateralmente. Un enfoque alternativo es mover el plano de la imagen a través de la muestra para crear la pila de imágenes. [31]
Se pueden llevar a cabo experimentos largos, por ejemplo, con pilas registradas cada 10 segundos – 10 minutos durante el período de días. Esto permite estudiar los cambios a lo largo del tiempo en 3D, o la llamada microscopía 4D.
Después de la adquisición de imágenes, las diferentes pilas de imágenes se registran para formar un solo conjunto de datos 3D. Se pueden recopilar múltiples vistas de la muestra, ya sea intercambiando las funciones de los objetivos [31] o rotando la muestra. [8] Tener varias vistas puede generar más información que una sola pila; por ejemplo, se puede superar la oclusión de algunas partes de la muestra. Las vistas múltiples también mejoran la resolución de la imagen 3D al superar la resolución axial deficiente, como se describe a continuación.
Algunos estudios también utilizan un SPIM para obtener imágenes de solo una porción de la muestra, pero con una resolución temporal mucho mayor. Esto permite, por ejemplo, observar el corazón palpitante de un embrión de pez cebra en tiempo real. [32] Junto con las etapas de traducción rápida para la muestra, se ha implementado un seguimiento de partículas 3D de alta velocidad. [33]
Poder de resolución
La resolución lateral de un SPIM es comparable a la de un microscopio de fluorescencia estándar (epi), ya que está totalmente determinada por el objetivo de detección y la longitud de onda de la luz detectada (consulte el límite de Abbe ). Por ejemplo, para la detección en la región espectral verde alrededor de 525 nm, se puede alcanzar una resolución de 250–500 nm. [7] La resolución axial es peor que la lateral (alrededor de un factor de 4), pero se puede mejorar usando una hoja de luz más delgada, en cuyo caso es posible una resolución casi isotrópica. [19] Las láminas de luz más delgadas son delgadas solo en una región pequeña (para haces gaussianos ) o bien se deben usar perfiles de haz especializados como los haces de Bessel (además de la complejidad adicional, estos esquemas agregan lóbulos laterales que pueden ser perjudiciales [13] ). Alternativamente, la resolución isotrópica se puede lograr combinando computacionalmente pilas de imágenes 3D tomadas de la misma muestra bajo diferentes ángulos. Luego, la información de resolución de profundidad que falta en una pila se suministra desde otra pila; por ejemplo, con dos pilas ortogonales, la dirección axial (de baja resolución) en una pila es una dirección lateral (de alta resolución) en la otra pila.
La resolución lateral de LSFM se puede mejorar más allá del límite de Abbe, mediante el uso de técnicas de microscopía de superresolución, por ejemplo, utilizando el hecho de que los fluoróforos individuales se pueden ubicar con una precisión espacial mucho mayor que la resolución nominal del sistema óptico utilizado (ver localización estocástica técnicas de microscopía ). [22] También se han aplicado técnicas de iluminación estructurada para mejorar aún más la capacidad de corte óptico de LSFM. [23]
Artefactos de rayas
Como la iluminación penetra típicamente en la muestra desde un lado, los obstáculos que se interponen en el camino de la hoja de luz pueden alterar su calidad al dispersar y / o absorber la luz. Por lo general, esto conduce a rayas oscuras y brillantes en las imágenes. Si partes de las muestras tienen un índice de refracción significativamente más alto (por ejemplo, vesículas lipídicas en las células), también pueden producir un efecto de enfoque que da como resultado rayas brillantes detrás de estas estructuras. Para superar este artefacto, las hojas de luz pueden, por ejemplo, ser "pivotantes". Eso significa que la dirección de incidencia de la hoja de luz cambia rápidamente (velocidad de ~ 1 kHz) en unos pocos grados (~ 10 °), por lo que la luz también golpea las regiones detrás de los obstáculos. La iluminación también se puede realizar con dos láminas de luz (pivotantes) (ver arriba) para reducir aún más estos artefactos. [8] Alternativamente, se ha desarrollado un algoritmo llamado VSNR (Variational Stationary Noise Remover) y está disponible como un complemento gratuito de Fiji. [34]
Historia
A principios del siglo XX, RA Zsigmondy introdujo el ultramicroscopio como un nuevo esquema de iluminación en la microscopía de campo oscuro. Aquí se utiliza la luz del sol o una lámpara blanca para iluminar una rendija de precisión. Luego, una lente de condensador crea una imagen de la rendija en la muestra para formar una hoja de luz. Las partículas dispersas (subdifractivas) se pueden observar perpendicularmente con un microscopio. Esta configuración permitió la observación de partículas con tamaños más pequeños que la resolución del microscopio y llevó a un premio Nobel para Zsigmondy en 1925. [35]
La primera aplicación de este esquema de iluminación para microscopía de fluorescencia fue publicada en 1993 por Voie et al. bajo el nombre de sección óptica de fluorescencia en plano ortogonal (OPFOS). [4] para obtener imágenes de la estructura interna de la cóclea . La resolución en ese momento se limitó a 10 µm lateralmente y 26 µm longitudinalmente, pero a un tamaño de muestra en el rango de milímetros. El microscopio OPFOS utilizó una lente cilíndrica simple para la iluminación. En 2004 se inició un mayor desarrollo y mejora del SPIM. [5] Después de esta publicación de Huisken et al. la técnica encontró una amplia aplicación y todavía se adapta a las nuevas situaciones de medición en la actualidad (ver arriba). Desde 2010, un primer ultramicroscopio con excitación de fluorescencia y resolución limitada [36] y desde 2012 un primer SPIM están disponibles comercialmente. [37] En la ref. [38] Durante 2012 también han comenzado a aparecer proyectos de código abierto que publican libremente planos de construcción completos para LSFM y también las suites de software necesarias. [39] [40] [41] [42]
Aplicaciones
SPIM / LSFM se utiliza a menudo en biología del desarrollo, donde permite observaciones a largo plazo (varios días) del desarrollo embrionario (incluso con la reconstrucción completa del árbol del linaje). [5] [43] SPIM también se puede combinar con técnicas, como la espectroscopia de correlación de fluorescencia para permitir mediciones de movilidad resueltas espacialmente de partículas fluorescentes (por ejemplo, perlas fluorescentes, puntos cuánticos o proteínas fluorescentes) dentro de muestras biológicas vivas. [19] [20]
El tejido biológico muy disperso, como el cerebro o el riñón, debe fijarse y limpiarse químicamente antes de que se pueda obtener una imagen en un SPIM. [44] Se han desarrollado técnicas especiales de limpieza de tejidos para este propósito, por ejemplo , 3DISCO , CUBIC y CLARITY . Dependiendo del índice de refracción de la muestra despejada, se deben utilizar fluidos de inmersión coincidentes y objetivos especiales de larga distancia durante la obtención de imágenes.
- "> Reproducir medios
Imágenes SPIM de un esferoide vivo que expresa H2B-HcRed. Se registraron pilas en Z de 100 cortes con un espaciado de corte de 1 μm cada tres minutos (objetivo 10 ×, NA = 0,3). La proyección máxima de las pilas z se muestra para cada punto de tiempo. [45]
Imágenes de amebas marcadas con DiI que se mueven libremente, obtenidas utilizando el ezDSLM. [46]
Células HeLa que expresan tetrámeros de la proteína verde fluorescente . A la izquierda se muestra una imagen de iluminación de transmisión y a la derecha una imagen LSFM. Los artefactos típicos de SPIM, como las sombras, se pueden ver con claridad. La hoja de luz se dirigió de abajo hacia arriba.
Reconstrucción volumétrica del z-stack en la imagen de arriba.