La secuenciación de microARN (miRNA-seq) , un tipo de RNA-Seq , es el uso de secuenciación de próxima generación o secuenciación de ADN de alto rendimiento masivamente paralela para secuenciar microARN , también llamados miARN. miRNA-seq difiere de otras formas de RNA-seq en que el material de entrada a menudo se enriquece con ARN pequeños. miRNA-seq permite a los investigadores examinar patrones de expresión específicos de tejido, asociaciones de enfermedades e isoformas de miRNA, y descubrir miRNA previamente no caracterizados. La evidencia de que los miARN desregulados desempeñan un papel en enfermedades como el cáncer [1] ha posicionado a miARN-seq para convertirse potencialmente en una herramienta importante en el futuro para el diagnóstico y el pronóstico a medida que los costos continúan disminuyendo.[2] Al igual que otras tecnologías de creación de perfiles de miARN, miARN-Seq tiene tanto ventajas (independencia de secuencia, cobertura) como desventajas (alto costo, requisitos de infraestructura, longitud de ejecución y artefactos potenciales). [3]
Introducción
Los microARN (miARN) son una familia de ácidos ribonucleicos pequeños, de 21 a 25 nucleótidos de longitud, que modulan la expresión de proteínas mediante la degradación de la transcripción, la inhibición de la traducción o el secuestro de las transcripciones. [4] [5] [6] El primer miARN que se descubrió, lin-4 , se encontró en una pantalla de mutagénesis genética para identificar elementos moleculares que controlan el desarrollo post-embrionario del nematodo Caenorhabditis elegans . [7] El gen lin-4 codificaba un ARN de 22 nucleótidos con sitios de unión complementarios conservados en la región 3 'sin traducir de la transcripción del ARNm lin-14 [8] y la expresión de la proteína LIN-14 regulada negativamente. [9] Se cree que los miARN están involucrados en la regulación de muchos procesos biológicos y de desarrollo, incluida la hematopoyesis ( miR-181 en Mus musculus [10] ), el metabolismo de los lípidos ( miR-14 en Drosophila melanogaster [11] ) y el desarrollo neuronal ( lsy-6 en Caenorhabditis elegans [12] ). [6] Estos descubrimientos requirieron el desarrollo de técnicas capaces de identificar y caracterizar miARN, como miARN-seq.
Historia
La secuenciación de microARN (miARN-seq) se desarrolló para aprovechar la secuenciación de próxima generación o las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento masivamente paralelas para encontrar nuevos miARN y sus perfiles de expresión en una muestra determinada. La secuenciación de miARN en sí misma no es una idea nueva, los métodos iniciales de secuenciación utilizaron métodos de secuenciación de Sanger . La preparación de la secuenciación implicó la creación de bibliotecas mediante la clonación de ADN transcrito de forma inversa a partir de ARN endógenos pequeños de 21-25 pb de tamaño seleccionados mediante electroforesis en columna y en gel . [13] Sin embargo, este método es exhaustivo en términos de tiempo y recursos, ya que cada clon debe amplificarse individualmente y prepararse para la secuenciación. Este método también favorece inadvertidamente a los miARN que están altamente expresados. [6] La secuenciación de próxima generación elimina la necesidad de sondas de hibridación específicas de secuencia requeridas en el análisis de microarrays de ADN , así como los laboriosos métodos de clonación requeridos en el método de secuenciación de Sanger. Además, las plataformas de secuenciación de próxima generación en el método miRNA-SEQ facilitan la secuenciación de grandes grupos de ARN pequeños en una única secuencia de secuenciación. [14]
miRNA-seq se puede realizar usando una variedad de plataformas de secuenciación. El primer análisis de ARN pequeños utilizando métodos de miARN-seq examinó aproximadamente 1,4 millones de ARN pequeños de la planta modelo Arabidopsis thaliana utilizando la plataforma de secuenciación Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) de Lynx Therapeutics . Este estudio demostró el potencial de las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para el estudio de ARN pequeños, y mostró que los genomas generan una gran cantidad de ARN pequeños con plantas como fuentes particularmente ricas de ARN pequeños. [15] Estudios posteriores utilizaron otras tecnologías de secuenciación, como un estudio en C. elegans que identificó 18 genes de miARN nuevos, así como una nueva clase de ARN pequeños de nematodos denominados ARN 21U . [16] Otro estudio que comparó pequeños perfiles de ARN de tumores cervicales humanos y tejido normal, utilizó el analizador de genomas Illumina (empresa) para identificar 64 nuevos genes de miARN humanos, así como 67 miARN expresados diferencialmente. [17] La plataforma de secuenciación SOLiD de Applied Biosystems también se ha utilizado para examinar el valor pronóstico de los miARN en la detección del cáncer de mama humano. [18]
Métodos
Preparación de ARN pequeño
La construcción de la biblioteca de secuencias se puede realizar usando una variedad de kits diferentes dependiendo de la plataforma de secuenciación de alto rendimiento que se utilice. Sin embargo, existen varios pasos comunes para la preparación de secuenciación de ARN pequeño. [19] [20]
Aislamiento de ARN total
En una muestra determinada, todo el ARN se extrae y se aísla utilizando un método de isotiocianato / fenol / cloroformo (GITC / fenol) o un producto comercial como el reactivo Trizol ( Invitrogen ). Una cantidad inicial de 50-100 μg de ARN total, 1 g de tejido normalmente produce 1 mg de ARN total, generalmente se requiere para la purificación del gel y la selección del tamaño. [20] También se mide el control de calidad del ARN, por ejemplo, ejecutando un chip de ARN en Caliper LabChipGX ( Caliper Life Sciences ).
Fraccionamiento por tamaño de ARN pequeños mediante electroforesis en gel
El ARN aislado se procesa en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se utiliza un método de formación de imágenes como los oligonucleótidos marcados con 5'-32P radiactivos junto con una escala de tamaño para identificar una sección del gel que contiene ARN del tamaño apropiado, reduciendo la cantidad de material finalmente secuenciado. Este paso no tiene que realizarse necesariamente antes de los pasos de ligación y transcripción inversa que se describen a continuación. [19] [20]
Ligadura
El paso de ligación agrega adaptadores de ADN a ambos extremos de los ARN pequeños, que actúan como sitios de unión de cebadores durante la transcripción inversa y la amplificación por PCR . Un adaptador 3 'de ADN monocatenario adenilado seguido de un adaptador 5' se liga a los ARN pequeños usando una enzima de ligadura tal como ARN ligasa 2 de T4. Los adaptadores también están diseñados para capturar ARN pequeños con un grupo fosfato 5 ', microARN característicos, en lugar de productos de degradación del ARN con un grupo hidroxilo 5'. [19] [20]
Transcripción inversa y amplificación por PCR
Este paso convierte los ARN ligados al adaptador pequeño en clones de ADNc usados en la reacción de secuenciación. Hay muchos kits comerciales disponibles que llevarán a cabo este paso utilizando alguna forma de transcriptasa inversa . A continuación, se lleva a cabo la PCR para amplificar el conjunto de secuencias de ADNc. Los cebadores diseñados con etiquetas de nucleótidos únicas también se pueden usar en este paso para crear etiquetas de identificación en la secuenciación múltiple de bibliotecas agrupadas. [19] [20]
Secuenciación
La secuenciación de ARN real varía significativamente según la plataforma utilizada. Tres plataformas comunes de secuenciación de próxima generación [21] son Pyrosequencing en la plataforma 454 Life Sciences , [22] secuencia por síntesis basada en polimerasa en la plataforma Illumina (empresa) , [23] o secuenciación por ligación en la secuenciación sólida ABI plataforma. [24]
Análisis de los datos
Es fundamental para el análisis de datos de miARN-seq la capacidad de 1) obtener niveles de abundancia de miARN a partir de lecturas de secuencia, 2) descubrir nuevos miARN y luego ser capaz de 3) determinar el miARN expresado diferencialmente y sus 4) dianas de genes de ARNm asociados.
Alineación de miARN y cuantificación de abundancia
Los miARN pueden expresarse preferentemente en ciertos tipos de células, tejidos, etapas de desarrollo o, en particular, estados patológicos como el cáncer. [1] Dado que la secuenciación profunda (miRNA-seq) genera millones de lecturas de una muestra determinada, nos permite perfilar miRNA; ya sea cuantificando su abundancia absoluta, para descubrir sus variantes (conocidas como isomiros [25] ) Tenga en cuenta que dado que la longitud promedio de las lecturas de secuencia son más largas que el miARN promedio (17-25 nt), los valores 3 'y 5 Los extremos del miARN deben encontrarse en la misma lectura. Existen varios algoritmos de cuantificación de abundancia de miARN. [21] [26] Sus pasos generales son los siguientes: [27]
- Después de la secuenciación, las lecturas de la secuencia sin procesar se filtran según la calidad. Las secuencias del adaptador también se recortan de las lecturas de secuencias sin procesar.
- Las lecturas resultantes luego se formatean en un archivo fasta donde se registra el número de copia y la secuencia para cada etiqueta única.
- Las secuencias que pueden representar contaminación por E. Coli se identifican mediante una búsqueda BLAST contra una base de datos de E. Coli y se eliminan del análisis.
- Cada una de las secuencias restantes se alinean con una base de datos de secuencias de miARN (como miRBase [28] ). Para tener en cuenta el procesamiento DICER imperfecto, se permite un saliente 6nt en el extremo 3 'y 3nt en el extremo 5'.
- Las lecturas que no se alinean con la base de datos de miARN se alinean libremente con los precursores de miARN para detectar miARN que puedan portar mutaciones o que hayan pasado por la edición de ARN .
- Los recuentos de lectura para cada miARN se normalizan luego al número total de miARN mapeados para informar la abundancia de cada miARN.
Descubrimiento de miARN nuevo
Otra ventaja de miRNA-seq es que permite el descubrimiento de nuevos miRNA que pueden haber eludido los métodos tradicionales de detección y elaboración de perfiles. [27] Hay varios algoritmos novedosos de descubrimiento de miARN. Sus pasos generales son los siguientes:
- Obtenga lecturas que no se alineen con secuencias de miARN conocidas y mapeelas en el genoma.
- Método de plegado de ARN
- Para las secuencias de miARN donde se encuentra una coincidencia exacta, obtenga la secuencia genómica que incluya ~ 100 pb de secuencia flanqueante en cada lado y ejecute el ARN a través de un software de plegado de ARN como el paquete Vienna. [29]
- Las secuencias plegadas que se encuentran en un brazo de la horquilla de miARN y tienen una energía libre mínima de menos de ~ 25 kcal / mol se preseleccionan como miARN putativo.
- Las secuencias preseleccionadas se recortan para incluir solo la posible secuencia precursora y luego se vuelven a plegar para garantizar que el precursor no fue estabilizado artificialmente por secuencias vecinas.
- Las secuencias plegadas resultantes se consideran miARN nuevos si la secuencia de miARN se encuentra dentro de un brazo de la horquilla y están muy conservadas entre especies.
- Método de expresión de Star Strand (miRdeep [30] )
- Las nuevas secuencias de miARN se identifican en función del patrón de expresión característico que muestran debido al procesamiento de DICER: mayor expresión del miARN maduro sobre las secuencias de la hebra en estrella y el bucle.
Análisis de expresión diferencial
Después de cuantificar la abundancia de miARN para cada muestra, sus niveles de expresión se pueden comparar entre muestras. Entonces, uno podría identificar miARN que se expresan preferentemente en puntos de tiempo particulares, o en tejidos o estados patológicos particulares. Después de normalizar el número de lecturas mapeadas entre muestras, se puede utilizar una serie de pruebas estadísticas (como las que se utilizan en el perfil de expresión génica ) para determinar la expresión diferencial.
Predicción de destino
La identificación de los objetivos de ARNm de un miARN proporcionará una comprensión de los genes o redes de genes cuya expresión regulan. [31] Las bases de datos públicas proporcionan predicciones de objetivos de miARN. Pero para distinguir mejor las predicciones positivas verdaderas de las predicciones positivas falsas, los datos de miRNA-seq se pueden integrar a los datos de mRNA-seq para observar los pares funcionales de miRNA: mRNA. RNA22, [32] TargetScan , [33] [34] [35] [36] [37] [38] miRanda, [39] y PicTar [40] son software diseñados para este propósito. Aquí se proporciona una lista de software de predicción . Los pasos generales son:
- Determinación de pares de unión de miARN: ARNm, se identifica la complementariedad entre las secuencias de miARN en el 3'-UTR de la secuencia de ARNm.
- Determinar el grado de conservación de pares de unión de miARN: ARNm entre especies. Normalmente, es menos probable que los pares de mayor unión sean falsos positivos de predicción.
- Observe la evidencia de que miRNA se dirige en mRNA-seq o datos de expresión de proteínas: donde la expresión de miRNA es alta, la expresión de genes y proteínas de su gen objetivo debe ser baja.
Validación de objetivos para objetivos de ARNm escindidos
Muchos miARN funcionan para dirigir la escisión de sus dianas de ARNm; esto es particularmente cierto en plantas y, por lo tanto, se han desarrollado métodos de secuenciación de alto rendimiento para aprovechar esta propiedad de los miARN mediante la secuenciación de los extremos 3 'descubiertos de los ARNm escindidos o degradados. Estos métodos se conocen como secuenciación de Degradome o PARE. [41] [42] La validación de la escisión de la diana en ARNm específicos se realiza normalmente utilizando una versión modificada de 5 ' Amplificación rápida de extremos de ADNc con un cebador específico de gen.
Aplicaciones
Identificación de nuevos miARN
miRNA-seq ha revelado nuevos miRNA que anteriormente se eludían en los métodos tradicionales de elaboración de perfiles de miRNA. Ejemplos de tales hallazgos son las células madre embrionarias, [25] embriones de pollo, [43] leucemia linfoblástica aguda, [44] linfoma difuso de células B grandes y células B, [45] leucemia mieloide aguda, [46] y cáncer de pulmón. . [47]
Biomarcadores de enfermedades
Los micro ARN son reguladores importantes de casi todos los procesos celulares como la supervivencia, la proliferación y la diferenciación . En consecuencia, no es inesperado que los miARN estén involucrados en varios aspectos del cáncer a través de la regulación de la expresión de genes supresores de tumores y onco . En combinación con el desarrollo de métodos de elaboración de perfiles de alto rendimiento, los miARN se han identificado como biomarcadores para la clasificación del cáncer, la respuesta a la terapia y el pronóstico. [48] Además, debido a que los miARN regulan la expresión génica, también pueden revelar perturbaciones en importantes redes reguladoras que pueden estar impulsando un trastorno en particular. [48] A continuación se ofrecen varias aplicaciones de los miARN como biomarcadores y predictores de enfermedades.
Tipo de cáncer | miARN α | Árbitro. |
---|---|---|
Seno | ||
Estado de ER | miR-26a / b, familia miR-30, miR-29b, miR-155, miR-342, miR-206, miR-191 | [49] [50] [51] [52] |
Estado de relaciones públicas | let-7c, miR-29b, miR-26a, familia miR-30, miR-520g | [52] [53] |
HER2 / neu estado | miR-520d, miR-181c, miR-302c, miR-376b, miR-30e | [49] [53] |
Pulmón | ||
Célula escamosa vs no escamosa | miR-205 | [54] |
Celda pequeña vs celda no pequeña | miR-17-5p, miR-22, miR-24, miR-31 | [48] |
Gástrico | ||
Difuso vs intestinal | miR-29b / c, familia miR-30, miR-135a / b | [55] |
Endometrial | ||
Endometrioide vs papilar uterino | miR-19a / b, miR-30e-5p, miR-101, miR-452, miR-382, miR-15a, miR-29c | [56] |
Renal | ||
Célula clara vs papilar | miR-424, miR-203, miR-31, miR-126 | [57] |
Oncocitoma vs cromófobo | miR-200c, miR-139-5p | [57] |
Mieloma | ||
con t (14; 16) | miR-1, miR-133a | [58] |
con t (4; 14) | miR-203, miR-155, miR-375 | [58] |
con t (11; 14) | miR-125a, miR-650, miR-184 | [58] |
Leucemia mieloide aguda | ||
con t (15; 17) | miR-382, miR-134, miR-376a, miR-127, miR-299-5p, miR-323 | [59] |
con t (8; 21) o inv (16) | let-7b / c, miR-127 | [59] |
con mutaciones NPM1 | miR-10a / b, let-7, miR-29, miR-204, miR-128a, miR-196a / b | [59] [60] |
con FLT3 ITD | miR-155 | [59] [60] [61] |
Leucemia linfocítica crónica | ||
Niveles de ZAP-70 y estado de IgVH | miR-15a, miR-195, miR-221, miR-155, miR-23b | [62] |
Melanoma | ||
con BRAF V600E | miR-193a, miR-338, miR-565 | [63] |
Linfoma | ||
Linfoma difuso de células B grandes | has-miR-128, has-miR-129-3p, has-miR-152, has-miR-155, has-miR-185, has-miR-193a-5p, has-miR-196b, has-miR- 199b-3p, has-miR-20b, has-miR-23a, has-miR-27a, has-miR-28-5p, has-miR-301a, has-miR-331-3p, has-miR-365, has-miR-625, has-miR-9 | [45] |
α Ésta no es una lista completa de miARN involucrados con estas neoplasias malignas.
Comparación con otros métodos de elaboración de perfiles de miARN
Las desventajas de usar miRNA-seq sobre otros métodos de perfilado de miRNA son que es más caro, generalmente requiere una mayor cantidad de RNA total, implica una amplia amplificación y consume más tiempo que los métodos de microarrays y qPCR. [3] Además, los métodos de preparación de bibliotecas de miARN-seq parecen tener una representación preferencial sistemática del complemento de miARN, y esto impide la determinación precisa de la abundancia de miARN. [64] Al mismo tiempo, el enfoque es independiente de la hibridación y, por lo tanto, no requiere información de secuencia a priori . Debido a esto, se pueden obtener secuencias de miARN novedosos e isoformas de miARN (isoMirs), distinguir miARN secuencialmente similares e identificar mutaciones puntuales. [sesenta y cinco]
Comparación de plataformas de perfiles de miARN
[3]
qPCR | Microarray | Secuenciación | |
---|---|---|---|
Tiempo de procesamiento | ~ 6 horas | ~ 2 días | 1-2 semanas |
ARN total requerido | 500 ng | 100-1.000 ng | 500-5.000 ng |
Rango dinámico detectado | Seis órdenes de magnitud | Cuatro órdenes de magnitud | Cinco o más órdenes de magnitud |
Infraestructura y requisitos técnicos | Pocos | Moderar | Sustancial |
Costo por muestra (USD) | $ 400 | $ 250– $ 350 | $ 500– $ 700 |
Referencias
- ^ a b Farazi, Thalia A; Spitzer, Jessica I; Morozov, Pavel; Tuschl, Thomas (2011). "miARN en cáncer humano" . La Revista de Patología . 223 (2): 102-115. doi : 10.1002 / ruta.2806 . ISSN 0022-3417 . PMC 3069496 . PMID 21125669 .
- ^ Sandhu, S .; Garzón, R. (2011). "Aplicaciones potenciales de los microARN en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer". Semin Oncol . 38 (6): 781–787. doi : 10.1053 / j.seminoncol.2011.08.007 . PMID 22082764 .
- ^ a b c Baker, Monya (2010). "Perfilado de microARN: separación de señal de ruido" . Métodos de la naturaleza . 7 (9): 687–692. doi : 10.1038 / nmeth0910-687 . ISSN 1548-7091 . PMID 20805796 . S2CID 6853222 .
- ^ Kim, V. Narry ; Han, Jinju; Siomi, Mikiko C. (2009). "Biogénesis de pequeños ARN en animales". Nature Reviews Biología celular molecular . 10 (2): 126-139. doi : 10.1038 / nrm2632 . ISSN 1471-0072 . PMID 19165215 . S2CID 8360619 .
- ^ Bartel, D (2004). "MicroRNAsGenomics, biogénesis, mecanismo y función". Celular . 116 (2): 281-297. doi : 10.1016 / S0092-8674 (04) 00045-5 . ISSN 0092-8674 . PMID 14744438 . S2CID 2669459 .
- ^ a b c Él, Lin; Hannon, Gregory J. (2004). "MicroARN: pequeños ARN con un gran papel en la regulación de genes". Nature Reviews Genética . 5 (7): 522–531. doi : 10.1038 / nrg1379 . ISSN 1471-0056 . PMID 15211354 . S2CID 86602746 .
- ^ Ambros, Victor (1989). "Una jerarquía de genes reguladores controla un cambio de desarrollo de larva a adulto en C. elegans". Celular . 57 (1): 49–57. doi : 10.1016 / 0092-8674 (89) 90171-2 . ISSN 0092-8674 . PMID 2702689 . S2CID 13103224 .
- ^ Lee, Rosalind C .; Feinbaum, Rhonda L .; Ambros, Victor (1993). "El gen heterocrónico de C. elegans lin-4 codifica pequeños ARN con complementariedad antisentido con lin-14" . Celular . 75 (5): 843–854. doi : 10.1016 / 0092-8674 (93) 90529-Y . ISSN 0092-8674 . PMID 8252621 .
- ^ Wightman, Bruce; Ha, Ilho; Ruvkun, Gary (1993). "Regulación postranscripcional del gen heterocrónico lin-14 por lin-4 media la formación de patrones temporales en C. elegans" . Celular . 75 (5): 855–862. doi : 10.1016 / 0092-8674 (93) 90530-4 . ISSN 0092-8674 . PMID 8252622 .
- ^ Chen, C.-Z. (2004). "Los microARN modulan la diferenciación del linaje hematopoyético" (PDF) . Ciencia . 303 (5654): 83–86. Código Bibliográfico : 2004Sci ... 303 ... 83C . doi : 10.1126 / science.1091903 . hdl : 1721,1 / 7483 . ISSN 0036-8075 . PMID 14657504 . S2CID 7044929 .
- ^ Xu, Peizhang; Vernooy, Stephanie Y .; Guo, Ming; Hay, Bruce A. (2003). "El Drosophila MicroRNA Mir-14 suprime la muerte celular y es necesario para el metabolismo normal de las grasas" (PDF) . Biología actual . 13 (9): 790–795. doi : 10.1016 / S0960-9822 (03) 00250-1 . ISSN 0960-9822 . PMID 12725740 . S2CID 6391484 .
- ^ Johnston, Robert J .; Hobert, Oliver (2003). "Un microARN que controla la asimetría neuronal izquierda / derecha en Caenorhabditis elegans". Naturaleza . 426 (6968): 845–849. Código Bibliográfico : 2003Natur.426..845J . doi : 10.1038 / nature02255 . ISSN 0028-0836 . PMID 14685240 . S2CID 4410288 .
- ^ Lee, RC (2001). "Una clase extensa de ARN pequeños en Caenorhabditis elegans". Ciencia . 294 (5543): 862–864. Código bibliográfico : 2001Sci ... 294..862L . doi : 10.1126 / science.1065329 . ISSN 0036-8075 . PMID 11679672 . S2CID 33480585 .
- ^ Aldridge, Sarah; Hadfield, James (2012). Introducción a las tecnologías de creación de perfiles de miARN y la comparación entre plataformas . Métodos en Biología Molecular. 822 . Tecnología de generación de perfiles de expresión de microARN de próxima generación. págs. 19–31. doi : 10.1007 / 978-1-61779-427-8_2 . ISBN 978-1-61779-426-1. ISSN 1064-3745 . PMID 22144189 .
- ^ Lu, C; Tej, SS; Luo, S; Haudenschild, CD; Meyers, BC; Green, PJ (2 de septiembre de 2005). "Elucidación del pequeño componente de ARN del transcriptoma". Ciencia . 309 (5740): 1567–9. Código Bibliográfico : 2005Sci ... 309.1567L . doi : 10.1126 / science.1114112 . PMID 16141074 . S2CID 1651848 .
- ^ Ruby, J. Graham; Jan, Calvin; Jugador, Christopher; Axtell, Michael J .; Lee, William; Nusbaum, Chad; Ge, Hui; Bartel, David P. (2006). "La secuenciación a gran escala revela 21U-ARN y microARN adicionales y ARNip endógenos en C. elegans". Celular . 127 (6): 1193–1207. doi : 10.1016 / j.cell.2006.10.040 . ISSN 0092-8674 . PMID 17174894 . S2CID 16838469 .
- ^ Witten, Daniela; Tibshirani, Robert; Gu, Sam; Fuego, Andrew; Lui, Weng-Onn (2010). "Descubrimiento de ARN pequeño basado en secuenciación de ultra alto rendimiento y análisis de biomarcadores estadísticos discretos en una colección de tumores cervicales y controles emparejados" . Biología BMC . 8 (1): 58. doi : 10.1186 / 1741-7007-8-58 . ISSN 1741-7007 . PMC 2880020 . PMID 20459774 .
- ^ Wu, Qian; Lu, Zuhong; Li, granizo; Lu, Jiafeng; Guo, Li; Ge, Qinyu (2011). "Secuenciación de nueva generación de microARN para la detección del cáncer de mama" . Revista de Biomedicina y Biotecnología . 2011 : 1–7. doi : 10.1155 / 2011/597145 . ISSN 1110-7243 . PMC 3118289 . PMID 21716661 .
- ^ a b c d Lu, C; Meyers, BC; Green, PJ (octubre de 2007). "Construcción de pequeñas bibliotecas de ADNc de ARN para secuenciación profunda". Métodos . 43 (2): 110–7. doi : 10.1016 / j.ymeth.2007.05.002 . PMID 17889797 .
- ^ a b c d e Hafner, Markus; Landgraf, Pablo; Ludwig, Janos; Rice, Amanda; Ojo, Tolulope; Lin, Carolina; Holoch, Daniel; Lim, Cindy; Tuschl, Thomas (2008). "Identificación de microARN y otros ARN reguladores pequeños mediante secuenciación de la biblioteca de ADNc" . Métodos . 44 (1): 3–12. doi : 10.1016 / j.ymeth.2007.09.009 . ISSN 1046-2023 . PMC 2847350 . PMID 18158127 .
- ^ a b Shendure, Jay; Ji, Hanlee (2008). "Secuenciación de ADN de próxima generación". Biotecnología de la naturaleza . 26 (10): 1135-1145. doi : 10.1038 / nbt1486 . ISSN 1087-0156 . PMID 18846087 . S2CID 6384349 .
- ^ "Copia archivada" . Archivado desde el original el 26 de mayo de 2011 . Consultado el 1 de marzo de 2012 .Mantenimiento de CS1: copia archivada como título ( enlace )
- ^ http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=204
- ^ "Copia archivada" . Archivado desde el original el 16 de mayo de 2008 . Consultado el 16 de mayo de 2008 .Mantenimiento de CS1: copia archivada como título ( enlace )
- ^ a b Morin, RD; O'Connor, MD; Griffith, M .; Kuchenbauer, F .; Delaney, A .; Prabhu, A.-L .; Zhao, Y .; McDonald, H .; Zeng, T .; Hirst, M .; Aleros, CJ; Marra, MA (2008). "Aplicación de secuenciación masivamente paralela a la elaboración de perfiles de microARN y descubrimiento en células madre embrionarias humanas" . Investigación del genoma . 18 (4): 610–621. doi : 10.1101 / gr.7179508 . ISSN 1088-9051 . PMC 2279248 . PMID 18285502 .
- ^ Berninger, Philipp; Gaidatzis, Dimos; van Nimwegen, Erik; Zavolan, Mihaela (2008). "Análisis computacional de datos de clonación de ARN pequeño". Métodos . 44 (1): 13-21. doi : 10.1016 / j.ymeth.2007.10.002 . ISSN 1046-2023 . PMID 18158128 .
- ^ a b Creighton, CJ; Reid, JG; Gunaratne, PH (2009). "Perfil de expresión de microARN mediante secuenciación profunda" . Briefings en Bioinformática . 10 (5): 490–497. doi : 10.1093 / bib / bbp019 . ISSN 1467-5463 . PMC 2733187 . PMID 19332473 .
- ^ Kozomara, A .; Griffiths-Jones, S. (2010). "miRBase: integración de anotación de microARN y datos de secuenciación profunda" . Investigación de ácidos nucleicos . 39 (Base de datos): D152 – D157. doi : 10.1093 / nar / gkq1027 . ISSN 0305-1048 . PMC 3013655 . PMID 21037258 .
- ^ Hofacker, IL; Fontana, W .; Stadler, PF; Bonhoeffer, LS; Tacker, M .; Schuster, P. (1994). "Plegado rápido y comparación de estructuras secundarias de ARN". Monatshefte für Chemie . 125 (2): 167–188. doi : 10.1007 / BF00818163 . ISSN 0026-9247 . S2CID 19344304 .
- ^ Yang, X .; Li, L. (2011). "miRDeep-P: una herramienta computacional para analizar el transcriptoma de microARN en plantas". Bioinformática . 27 (18): 2614–5. doi : 10.1093 / bioinformatics / btr430 . ISSN 1367-4803 . PMID 21775303 .
- ^ Cloonan, Nicole; Wani, Shivangi; Xu, Qinying; Gu, Jian; Lea, Kristi; Calentador, Sheila; Barbacioru, Catalin; Steptoe, Anita L; Martin, Hilary C; Nourbakhsh, Ehsan; Krishnan, Keerthana; Gardiner, Brooke; Wang, Xiaohui; Nones, Katia; Steen, Jason A; Matigan, Nick; Wood, David L; Kassahn, Karin S; Waddell, Nic; Pastor, Jill; Lee, Clarence; Ichikawa, Jeff; McKernan, Kevin; Bramlett, Kelli; Kuersten, Scott; Grimmond, Sean M (2011). "Los microARN y sus isomiR funcionan de manera cooperativa para apuntar a vías biológicas comunes" . Biología del genoma . 12 (12): R126. doi : 10.1186 / gb-2011-12-12-r126 . ISSN 1465-6906 . PMC 3334621 . PMID 22208850 .
- ^ Miranda KC, Huynh T, Tay Y, Ang YS, Tam WL, Thomson AM, Lim B, Rigoutsos I (2006). "Un método basado en patrones para la identificación de sitios de unión de MicroRNA y sus correspondientes heterodúplex". Celular . 126 (6): 1203–17. doi : 10.1016 / j.cell.2006.07.031 . PMID 16990141 . S2CID 12749133 .
- ^ Lewis, BP; Burge CB; Bartel DP (14 de enero de 2005). "El emparejamiento de semillas conservadas, a menudo flanqueadas por adenosinas, indica que miles de genes humanos son objetivos de microARN". Celular . 120 (1): 15-20. doi : 10.1016 / j.cell.2004.12.035 . PMID 15652477 . S2CID 17316349 .
- ^ Grimson, A; Farh, KK; Johnston, WK; Garrett-Engele, P; Lim, LP; Bartel, DP (6 de julio de 2007). "Especificidad dirigida a microARN en mamíferos: determinantes más allá del emparejamiento de semillas" . Célula molecular . 27 (1): 91-105. doi : 10.1016 / j.molcel.2007.06.017 . PMC 3800283 . PMID 17612493 .
- ^ Friedman, RC; Farh, KK; Burge, CB; Bartel, DP (enero de 2009). "La mayoría de los ARNm de mamíferos son dianas conservadas de microARN" . Investigación del genoma . 19 (1): 92-105. doi : 10.1101 / gr.082701.108 . PMC 2612969 . PMID 18955434 .
- ^ García, DM; Baek, D; Shin, C; Bell, GW; Grimson, A; Bartel, DP (11 de septiembre de 2011). "La débil estabilidad de emparejamiento de semillas y la alta abundancia del sitio objetivo disminuyen la competencia de lsy-6 y otros microARN" . Naturaleza Biología Molecular y Estructural . 18 (10): 1139–46. doi : 10.1038 / nsmb.2115 . PMC 3190056 . PMID 21909094 .
- ^ Agarwal, Vikram; Bell, George W .; Nam, Jin-Wu; Bartel, David P. (12 de agosto de 2015). "Predicción de sitios diana de microARN efectivos en ARNm de mamíferos" . eLife . 4 : e05005. doi : 10.7554 / eLife.05005 . ISSN 2050-084X . PMC 4532895 . PMID 26267216 .
- ^ Agarwal, V; Subtelny, AO; Thiru, P; Ulitsky, yo; Bartel, DP (4 de octubre de 2018). "Predicción de la eficacia de focalización de microARN en Drosophila" . Biología del genoma . 19 (1): 152. doi : 10.1186 / s13059-018-1504-3 . PMC 6172730 . PMID 30286781 .
- ^ Maziere, P; Muy bien, A (2007). "Predicción de objetivos de microARN". Descubrimiento de drogas hoy . 12 (11-12): 452-458. doi : 10.1016 / j.drudis.2007.04.002 . ISSN 1359-6446 . PMID 17532529 .
- ^ Krek, A. Identificación de objetivos de microARN. DAI-B 70/07, (2010).
- ^ Alemán MA, Pillay M, Jeong DH, Hetawal A, Luo S, Janardhanan P, Kannan V, Rymarquis LA, Nobuta K, German R, De Paoli E, Lu C, Schroth G, Meyers BC, Green PJ (2008). "Identificación global de pares de microARN-ARN diana mediante análisis paralelo de extremos de ARN". Nat. Biotechnol . 26 (8): 941–946. doi : 10.1038 / nbt1417 . PMID 18542052 . S2CID 13187064 .
- ^ Addo-Quaye C, Eshoo TW, Bartel DP, Axtell MJ (2008). "Dianas endógenas de ARNip y miARN identificadas por secuenciación del degradome de Arabidopsis" . Curr. Biol . 18 (10): 758–762. doi : 10.1016 / j.cub.2008.04.042 . PMC 2583427 . PMID 18472421 .
- ^ Buermans, Henk PJ; Ariyurek, Yavuz; van Ommen, Gertjan; den Dunnen, Johan T; 't Hoen, Peter AC (2010). "Nuevos métodos para la generación de perfiles de expresión de microARN basados en secuenciación" . BMC Genomics . 11 (1): 716. doi : 10.1186 / 1471-2164-11-716 . ISSN 1471-2164 . PMC 3022920 . PMID 21171994 .
- ^ Zhang, Baohong; Zhang, Hua; Yang, Jian-Hua; Zheng, Yu-Sheng; Zhang, Peng; Chen, Xiao; Wu, Jun; Xu, Ling; Luo, Xue-Qun; Ke, Zhi-Yong; Zhou, Hui; Qu, Liang-Hu; Chen, Yue-Qin (2009). "Análisis de todo el genoma del descubrimiento de ARN pequeño y microARN nuevo en leucemia linfoblástica aguda humana basado en un amplio enfoque de secuenciación" . PLOS ONE . 4 (9): e6849. Código bibliográfico : 2009PLoSO ... 4.6849Z . doi : 10.1371 / journal.pone.0006849 . ISSN 1932-6203 . PMC 2731166 . PMID 19724645 .
- ^ a b Jima, DD; Zhang, J .; Jacobs, C .; Richards, KL; Dunphy, CH; Choi, WWL; Yan Au, W .; Srivastava, G .; Czader, MB; Rizzieri, DA; Lagoo, AS; Lugar, PL; Mann, KP; Flores, CR; Bernal-Mizrachi, L .; Naresh, KN; Evens, AM; Gordon, LI; Luftig, M .; Friedman, DR; Weinberg, JB; Thompson, MA; Gill, JI; Liu, Q .; Cómo T.; Grubor, V .; Gao, Y .; Patel, A .; Wu, H .; Zhu, J .; Blobe, GC; Lipsky, PE; Chadburn, A .; Dave, SS (2010). "La secuenciación profunda del transcriptoma de ARN pequeño de células B humanas normales y malignas identifica cientos de microARN nuevos" . Sangre . 116 (23): e118 – e127. doi : 10.1182 / blood-2010-05-285403 . ISSN 0006-4971 . PMC 3012600 . PMID 20733160 .
- ^ Starczynowski, DT; Morin, R .; McPherson, A .; Lam, J .; Chari, R .; Wegrzyn, J .; Kuchenbauer, F .; Hirst, M .; Tohyama, K .; Humphries, RK; Lam, WL; Marra, M .; Karsan, A. (2010). "Identificación de todo el genoma de microARN humanos ubicados en alteraciones genómicas asociadas a leucemia" . Sangre . 117 (2): 595–607. doi : 10.1182 / sangre-2010-03-277012 . ISSN 0006-4971 . PMID 20962326 .
- ^ Keller, Andreas; Backes, Christina; Leidinger, Petra; Kefer, Nathalie; Boisguerin, Valesca; Barbacioru, Catalin; Vogel, Britta; Matzas, Mark; Huwer, Hanno; Katus, Hugo A .; Stähler, Cord; Meder, Benjamín; Meese, Eckart (2011). "La secuenciación de próxima generación identifica nuevos microARN en sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón". Biosistemas moleculares . 7 (12): 3187–99. doi : 10.1039 / c1mb05353a . ISSN 1742-206X . PMID 22027949 .
- ^ a b c Chan, Elcie; Prado, Daniel Estévez; Weidhaas, Joanne Barnes (2011). "MicroARN de cáncer: de perfiles de subtipos a predictores de respuesta a la terapia" . Tendencias en Medicina Molecular . 17 (5): 235–243. doi : 10.1016 / j.molmed.2011.01.008 . ISSN 1471-4914 . PMC 3092835 . PMID 21354374 .
- ^ a b Blenkiron, Cherie; Goldstein, Leonard D; Thorne, Natalie P; Spiteri, Inmaculada; Chin, Suet-Feung; Dunning, Mark J; Barbosa-Morais, Nuno L; Teschendorff, Andrew E; Green, Andrew R; Ellis, Ian O; Tavaré, Simon ; Caldas, Carlos; Miska, Eric A (2007). "El perfil de expresión de microARN de cáncer de mama humano identifica nuevos marcadores de subtipo de tumor" . Biología del genoma . 8 (10): R214. doi : 10.1186 / gb-2007-8-10-r214 . ISSN 1465-6906 . PMC 2246288 . PMID 17922911 .
- ^ Sempere, LF; Christensen, M .; Silahtaroglu, A .; Bak, M .; Heath, CV; Schwartz, G .; Wells, W .; Kauppinen, S .; Cole, CN (2007). "Expresión de microARN alterada confinada a subpoblaciones de células epiteliales específicas en cáncer de mama" . Investigación del cáncer . 67 (24): 11612-11620. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-07-5019 . ISSN 0008-5472 . PMID 18089790 .
- ^ Mattie, Michael D; Benz, Christopher C; Bowers, Jessica; Sensinger, Kelly; Wong, Linda; Scott, Gary K; Fedele, Vita; Ginzinger, David; Getts, Robert; Haqq, Chris (2006). "El perfil optimizado de expresión de microARN de alto rendimiento proporciona una nueva evaluación de biomarcadores de biopsias clínicas de cáncer de mama y próstata" . Cáncer molecular . 5 (1): 24. doi : 10.1186 / 1476-4598-5-24 . ISSN 1476-4598 . PMC 1563474 . PMID 16784538 .
- ^ a b Iorio, MV; Ferracin, M .; Liu, C.-G .; Veronese, A .; Spizzo, R .; Sabbioni, S .; Magri, E .; Pedriali, M .; Fabbri, M .; Campiglio, M .; Menard, S .; Palazzo, JP; Rosenberg, A .; Musiani, P .; Volinia, S .; Nenci, I .; Calin, GA; Querzoli, P .; Negrini, M .; Croce, CM (2005). "Desregulación de la expresión génica de microARN en cáncer de mama humano" . Investigación del cáncer . 65 (16): 7065–7070. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-05-1783 . ISSN 0008-5472 . PMID 16103053 .
- ^ a b Lowery, Aoife J; Miller, Nicola; Devaney, Amanda; McNeill, Roisin E; Davoren, Pamela A; Lemetre, Christophe; Benes, Vladimir; Schmidt, Sabine; Blake, Jonathon; Ball, Graham; Kerin, Michael J (2009). "Las firmas de microARN predicen el estado del receptor de estrógeno, del receptor de progesterona y del receptor HER2 / neu en el cáncer de mama" . Investigación del cáncer de mama . 11 (3): R27. doi : 10.1186 / bcr2257 . ISSN 1465-5411 . PMC 2716495 . PMID 19432961 .
- ^ Líbano, D .; Benjamin, H .; Gilad, S .; Ezagouri, M .; Dov, A .; Ashkenazi, K .; Gefen, N .; Izraeli, S .; Rechavi, G .; Pase, H .; Nonaka, D .; Li, J .; Spector, Y .; Rosenfeld, N .; Chajut, A .; Cohen, D .; Aharonov, R .; Mansukhani, M. (2009). "Ensayo de diagnóstico basado en la expresión de hsa-miR-205 distingue el carcinoma de pulmón de células no pequeñas escamosas de las no escamosas". Revista de Oncología Clínica . 27 (12): 2030-2037. doi : 10.1200 / JCO.2008.19.4134 . ISSN 0732-183X . PMID 19273703 .
- ^ Ueda, Tetsuya; Volinia, Stefano; Okumura, Hiroshi; Shimizu, Masayoshi; Taccioli, Cristian; Rossi, Simona; Alder, Hansjuerg; Liu, Chang-gong; Oue, Naohide; Yasui, Wataru; Yoshida, Kazuhiro; Sasaki, Hiroki; Nomura, Sachiyo; Seto, Yasuyuki; Kaminishi, Michio; Calin, George A; Croce, Carlo M (2010). "Relación entre la expresión de microARN y la progresión y pronóstico del cáncer gástrico: un análisis de expresión de microARN" . The Lancet Oncology . 11 (2): 136-146. doi : 10.1016 / S1470-2045 (09) 70343-2 . ISSN 1470-2045 . PMC 4299826 . PMID 20022810 .
- ^ Ratner, Elena S .; Tuck, David; Richter, Christine; Nallur, Sunitha; Patel, Rajeshvari M .; Schultz, Vince; Hui, Pei; Schwartz, Peter E .; Rutherford, Thomas J .; Weidhaas, Joanne B. (2010). "Las firmas de microARN diferencian los subtipos de tumores de cáncer de útero" . Oncología Ginecológica . 118 (3): 251-257. doi : 10.1016 / j.ygyno.2010.05.010 . ISSN 0090-8258 . PMC 2918705 . PMID 20542546 .
- ^ a b Fridman, Eddie; Dotan, Zohar; Barshack, Iris; David, Miriam Ben; Dov, Avital; Tabak, Sarit; Sion, Orit; Benjamín, Sima; Benjamín, Hila; Kuker, Hagit; Avivi, Camila; Rosenblatt, Kinneret; Polak-Charcon, Sylvie; Ramón, Jacob; Rosenfeld, Nitzan; Spector, Yael (2010). "Clasificación molecular precisa de los tumores renales mediante expresión de microARN" . La Revista de Diagnóstico Molecular . 12 (5): 687–696. doi : 10.2353 / jmoldx.2010.090187 . ISSN 1525-1578 . PMC 2928434 . PMID 20595629 .
- ^ a b c Gutiérrez, Carolina del Norte; Sarasquete, ME; Misiewicz-Krzeminska, I; Delgado, M; De Las Rivas, J; Ticona, FV; Fermiñán, E; Martín-Jiménez, P; Chillón, C; Risueño, A; Hernández, JM; García-Sanz, R; González, M; San Miguel, JF (2010). "Desregulación de la expresión de microARN en los diferentes subtipos genéticos de mieloma múltiple y correlación con el perfil de expresión génica" . Leucemia . 24 (3): 629–637. doi : 10.1038 / leu.2009.274 . ISSN 0887-6924 . PMID 20054351 .
- ^ a b c d Jongen-Lavrencic, M .; Sun, SM; Dijkstra, MK; Valk, PJM; Lowenberg, B. (2008). "Perfiles de expresión de microARN en relación con la heterogeneidad genética de la leucemia mieloide aguda" . Sangre . 111 (10): 5078–5085. doi : 10.1182 / sangre-2008-01-133355 . ISSN 0006-4971 . PMID 18337557 .
- ^ a b Garzón, R .; Garofalo, M .; Martelli, diputado; Briesewitz, R .; Wang, L .; Fernandez-Cymering, C .; Volinia, S .; Liu, C.-G .; Schnittger, S .; Haferlach, T .; Liso, A .; Diverio, D .; Mancini, M .; Meloni, G .; Foa, R .; Martelli, MF; Mecucci, C .; Croce, CM; Falini, B. (2008). "Firma distintiva de microARN de leucemia mieloide aguda con nucleofosmina mutada citoplasmática" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 105 (10): 3945–3950. Código Bibliográfico : 2008PNAS..105.3945G . doi : 10.1073 / pnas.0800135105 . ISSN 0027-8424 . PMC 2268779 . PMID 18308931 .
- ^ Marcucci, Guido; Radmacher, Michael D .; Maharry, Kati; Mrózek, Krzysztof; Ruppert, Amy S .; Paschka, Peter; Vukosavljevic, Tamara; Whitman, Susan P .; Baldus, Claudia D .; Langer, Christian; Liu, Chang-Gong; Carroll, Andrew J .; Powell, Bayard L .; Garzón, Ramiro; Croce, Carlo M .; Kolitz, Jonathan E .; Caligiuri, Michael A .; Larson, Richard A .; Bloomfield, Clara D. (2008). "Expresión de microARN en leucemia mieloide aguda citogenéticamente normal". Revista de Medicina de Nueva Inglaterra . 358 (18): 1919–1928. doi : 10.1056 / NEJMoa074256 . ISSN 0028-4793 . PMID 18450603 .
- ^ Calin, George Adrian; Ferracin, Manuela; Cimmino, Amelia; Di Leva, Gianpiero; Shimizu, Masayoshi; Wojcik, Sylwia E .; Iorio, Marilena V .; Visone, Rosa; Sever, Nurettin Ilfer; Fabbri, Muller; Iuliano, Rodolfo; Palumbo, Tiziana; Pichiorri, Flavia; Roldo, Claudia; Garzón, Ramiro; Sevignani, Cinzia; Rassenti, Laura; Alder, Hansjuerg; Volinia, Stefano; Liu, Chang-gong; Kipps, Thomas J .; Negrini, Massimo; Croce, Carlo M. (2005). "Una firma de microARN asociada con el pronóstico y la progresión en la leucemia linfocítica crónica". Revista de Medicina de Nueva Inglaterra . 353 (17): 1793–1801. doi : 10.1056 / NEJMoa050995 . ISSN 0028-4793 . PMID 16251535 .
- ^ Caramuta, Stefano; Egyházi, Suzanne; Rodolfo, Monica; Witten, Daniela; Hansson, Johan; Larsson, Catharina; Lui, Weng-Onn (2010). "Perfiles de expresión de microARN asociados con el estado mutacional y la supervivencia en el melanoma maligno". Revista de Dermatología Investigativa . 130 (8): 2062-2070. doi : 10.1038 / jid.2010.63 . ISSN 0022-202X . PMID 20357817 .
- ^ Linsen, Sam EV; de Wit, Elzo; Janssens, Georges; Calentador, Sheila; Chapman, Laura; Parkin, Rachael K; Fritz, Brian; Wyman, Stacia K; de Bruijn, Ewart; Voest, Emile E; Kuersten, Scott; Tewari, Muneesh; Cuppen, Edwin (2009). "Limitaciones y posibilidades de perfiles de expresión de genes digitales de ARN pequeño". Métodos de la naturaleza . 6 (7): 474–476. doi : 10.1038 / nmeth0709-474 . ISSN 1548-7091 . PMID 19564845 . S2CID 7953265 .
- ^ Git, A .; Dvinge, H .; Salmon-Divon, M .; Osborne, M .; Kutter, C .; Hadfield, J .; Bertone, P .; Caldas, C. (2010). "Comparación sistemática de perfiles de microarrays, PCR en tiempo real y tecnologías de secuenciación de próxima generación para medir la expresión diferencial de microARN" . ARN . 16 (5): 991–1006. doi : 10.1261 / rna.1947110 . ISSN 1355-8382 . PMC 2856892 . PMID 20360395 .